弱毒化Vero毒素制造技术

本发明专利技术涉及一种弱毒化的毒素，更具体的说，本发明专利技术通过定点突变ＶＴ２ｖｐ１基因而获得微弱毒性突变ＶＴ２ｖｐ１基因和微弱毒性的突变毒素，在该毒素中，ＶＴ２ｖｐ１的Ａ亚基从Ｎ末端起第１６７位点处的ｇｌｕ和１７０位点处的ａｒｇ分别被谷氨酸盐和ｌｅｕ代替，该双突变体Ｅ１６７Ｑ－Ｒ１７０Ｌ比单突变体Ｅ１６７Ｑ表现出更低的蛋白质合成抑制活性、非洲绿猴肾细胞细胞内毒性和鼠致命性，因此适合用于制备疫苗和治疗细胞增生性疾病的药物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种弱毒化的毒素，编码该毒素的基因、载体、病毒及含该毒素或毒素基因载体的药物组合物。更具体的说，本专利技术提供了一种弱毒化的Vero毒素突变VT2vp1毒素，及编码该毒素的突变VT2vp1基因，含有该突变基因的载体、病毒和含有该毒素或毒素基因的用于治疗细胞增生性疾病的药物组合物。背量技术Vero毒素是由病原性大肠杆菌的一种肠道出血性大肠杆菌产生的。它是由有毒性的A亚基和与受体结合的B亚基构成的蛋白质性外毒素。如今，已发现的Vero毒素家族有VT1、VT2、VT2vha(VT2variant human a)、VT2 vhb、VT2vp1(VT2 variant porcine 1)和VT2vp2构成，其中发现VT2vp1与猪的浮肿病及人细胞增生性疾病有关(参见Linggood，M.A.，和Thompson，J.M.1987.Verotoxin production amongporcine strains of Escherichia coli and its association with edemadisease.J.Med.Microbiol.25359-362)。Endo等证实，VT2有RNA的N-糖苷酶活性，能够切除兔网状细胞核糖体60S亚基的构成成分28S核糖体RNA的N糖苷键，从而抑制蛋白质的合成(参见Endo，Y.，等.1988.Site of action of a Verotoxin(VT2)from Escherichia coli O157H7 and of Shiga toxin oneukaryotic ribosomes.Eur.J.Biochem.17145-50)。这些分子的作用机理和Endo及其同事报道的植物血凝素、蓖麻毒素是完全一样的。这些发现促使许多研究工作者通过比较Vero毒素的A亚基和蓖麻毒素的氨基酸序列，来寻找Vero毒素的酶活性中心。Hovde等第一个证实了VT1中的E167对于活性的重要性。利用定点突变技术将E167替换为天门冬氨酸将会降低其蛋白合成的抑制活性、细胞内毒性和鼠致命活性(参见Hovde，C.J等.1988.Evidence that glutamic acid 167 isan active-site residue of Shiga-like toxin I.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852568-2572)。Yamasaki等构建了22个编码VT1的突变基因，发现E167Q和R170L能大大降低其生物学活性(参见Yamasaki，S.等1991.Important of arginine at position 170 of the A subunit of Verotoxin 1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxinactivity.Microb.Pathog.111-9)。Ohmura等进一步的构建了E167Q-R170L的双突变体。并检测纯化的突变VT1的活性(参见Endo，Y等.1987.RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain.J.Biol.Chem.2628128-8130)。在VT2vp1中，Gordon等制备了E167Q、E167D和E167D-R170K，证实其中的E167Q毒性最低(参见Gordon等.1992.An enzymaticmutant of Shiga-like toxin II variant is a vaccine candidate for edemadisease of swine.Infect Immun.60485-490)。Macleod和Gyles报道了用戊二醛处理过的VT2vp1来免疫猪取得良好效果(参见Macleod等.1991.Immunization of pigs with a purified Shiga-like toxin II varianttoxoid.Vet.Microbiol.29309-318)。加入用VT2vp1类毒素来免疫能有效的防止猪浮肿的发生，那么和野生型VT2vp1有同样和相似抗原属性的无毒毒素突变体比用化学处理的类毒素应该更适合，因此Gordon等构建了VT2vp1的E167Q作为候选疫苗用来预防和治疗细胞增生性疾病。
技术实现思路
在本专利技术中，我们通过定点突变VT2vp1基因而获得弱毒性突变VT2vp1基因和弱毒性的突变毒素，在该毒素中，VT2vp1的A亚基从N末端起第167位点处的glu和170位点处的arg分别被谷氨酸盐和leu代替。我们发现双突变体E167Q-R170L表现出比单突变体E167Q有更低的活性。这个结果相对于Ohmura等以前所发现的在VT1中替换两个氨基酸，E167和R170没有表现出活性的降低来说是令人惊讶的。这种差异可能是由于VT1和VT1vp1突变体三维结构的不同从而影响了其活性。在本研究中将构建的E167Q-R170L作为类毒素候选疫苗，其中有几个优点(i)它的生物活性低于E167Q，其抑制蛋白质合成、细胞内毒性和鼠致命性分别大约是E167Q的1/2、1/10和1/4，(ii)该三种突变多肽被替换了两个氨基酸，降低了回复突变的可能性。(iii)中和抗E167Q-R170L细胞内毒性的活性与中和抗野生型VT2vp1细胞内毒性的活性相当。通过用VT2vp1特异性bead-ELISA技术，我们从猪中分离了VT2vp1株，但在人和牛中没有分离出来，这说明在生产VT2vp1的猪VTEC中存在一种独一无二的克隆因子，该克隆因子不能和牛及人的目的细胞相互作用。如果这个推断是事实的话，那么构建活的猪浮肿病及人细胞增生性疾病的口服疫苗是可能的，在该疫苗中，野生型的VT2vp1基因是被编码E167Q-R170L的基因体外替换。本专利技术的目的是提供一种弱毒化的Vero毒素，具体的说就是提供一种由A亚基从N末端起第167位点处的glu和170位点处的arg分别被谷氨酸盐和leu代替的突变VT2vp1编码的Vero毒素；并利用Vero毒素的基因编码的蛋白质合成具有阻碍癌细胞生长的抗癌剂，更具体的说也就是用病毒载体把弱毒化了的Vero毒素的A亚基或A、B亚基导入进癌细胞，并使其死亡。附图说明图1是纯化的突变VT2vp1毒素与野生型的VT2vp1毒素对兔网状细胞球蛋白抑制作用示意图。具体实施例方式本专利技术所用的菌株是E.coliO139H1(菌株号为KY010)，是由H.Tanaka从患浮肿病的猪中分离出来，并利用VT2vp1基因的特异性引物进行PCR证实了该菌株中仅仅含有VT2vp1基因。用PstI、Ecot22I和EcoRI消化E.coli KY010的基因组DNA，在Southern杂交中能与VT2特异性探针发生阳性反应的2.0kb的PstI片断被克隆到质粒pUC119中，制备质粒pKTN802，能与VT2特异性探针(含有来自pKTN802质粒的A亚基和B亚基的部分基因的0.22kb的HincII/PstI片断)发生阳性反应的4.3kb的EcoT221/EcoRI片断被克隆到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ序列，它编码弱毒化Ｖｅｒｏ毒素，并且具有下列序列之一：（ｉ）具有５’－ＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＣＴＧＴＴＣＡＧ－３’的核苷酸序列，（ｉｉ）在严格条件下与（ｉ）限定的ＤＮＡ序列杂交的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘笑燕，吉田秀男，任秀宝，黄宗堂，
申请(专利权)人：刘笑燕，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]