以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法技术

本发明专利技术涉及一种以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法，包括精子分离和冷冻保存，生产性别控制胚胎和胚胎性别鉴定步骤，其中精子分离和冷冻保存包括采集新鲜精液、分离前的精子处理、精子分离处理、冷冻保存；生产性别控制胚胎和胚胎性别鉴定步骤包括胚胎生产（体内或试管技术）、胚胎切割、ＰＣＲ法鉴定胚胎性别。本发明专利技术具有以下优点：分离精子的准确率达９０％以上，精子活力保持在５０％以上，胚胎的性别鉴定准确率约为１００％。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于一种家畜性别控制方法，特别涉及一种。
技术介绍
哺乳动物(含家畜)的性别由受精时精液中的X和Y精子来决定。X精子和卵子结合产生母性个体，Y精子则导致雄性个体的发生。在正常家畜精液中由于X精子和Y精子的比例相当，因此产生后代中的雌雄约各占50％。对于实际产业经营来说，如果能够把X精子和Y精子分开，就可以根据生产需要选择家畜的性别，比如肉牛繁殖者要求尽可能提高雄性牛犊的出生率，而奶牛经营者则认为多生母牛犊可以获取更大的经济效益。自从上世纪六十年代人工授精技术的普及应用，以及七十年代开始的胚胎移植技术的尝试，众多研究人员开始进行精子分离和胚胎性别鉴定的研究探讨。精子分离的基础是利用X精子和Y精子之间的理化、生理、遗传基因等方面的差异，比如重量、表面电荷、PH值以及抗原性等来设计各种实验模型，其中包括沉淀法、密度梯度离心法、电泳法、抗原抗体法等。但是上述诸方法由于分离精子的准确率差或者完全没有效果，对精子活力的损害等原因，到上世纪九十年代基本上被大多数研究人员的实验结果所否定，因此也就无法作为一项实用技术应用到生产实践。另外，胚胎的性别鉴定也是类似情况。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，它克服了上述的缺陷，以X精子和Y精子DNA含量的微小差别为基础的流式细胞分离法的准确率为90％，以人工授精为主的精子活力为50％，达到了产业应用水平；以Y精子特异性DNA片断为主的胚胎性别鉴定技术准确率接近100％。本专利技术，包括以下步骤(1)精子分离和冷冻保存A、从家畜体中采取新鲜精液1毫升，用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP，离心洗涤2次，2000转，5分钟，然后用所述的磷酸缓冲液把精子浓度调至100×106个/毫升，每毫升新鲜精液可调制10-15毫升上述浓度的稀释精液。B、在精液中添加10微克/毫升荧光染色剂，在37℃的条件下DNA染色30分钟，然后用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP，离心洗涤2次，2000转，5分钟；C、重新把精子浓度调至100×106个/毫升，然后装入流式细胞分离机内，以每秒钟3000个精子的速度进行分离，分开后的X精子和Y精子被回收后，按照每支250～500万个精子的总数，装入0.25毫升精液冷冻管，按照常规方法制成冷冻精液，保存于液化氮内，1毫升新鲜精液可以生产上述分离后的X精子或Y精子的冷冻精液各10-15支；D、生产性别控制胚胎把分离后的精子以每支200个卵子的比例进行体外授精和培养，可以生产25-30个经过性别控制的A-B等级胚胎(囊胚)，用于胚胎移植；(2)、胚胎性别鉴定A、以使用冷冻胚胎为主；B、胚胎细胞切割取解冻后的囊胚，在所述的磷酸缓冲液加0.25％的蛋白酶中处理2-3分钟，使胚胎的透明带软化，然后移入所述的磷酸缓冲液加0.3％的血清蛋白溶液中，每次处理胚胎数20-40个左右； C、在显微镜下，用刀端呈15°角，胚胎切割专用的金属刀片，或玻璃细针切下胚胎的营养层细胞10-15个，把切下的细胞和胚胎的主要部分，包括内胚团细胞，分别对应编号，胚胎的主要部分放入胚胎保存液TCM199-10％FBS中，在CO2培养箱中保留2-4小时；D、以一种DNA体外合成技术PCR法对切下的细胞进行雌、雄性别鉴定，切取的每个胚胎细胞样品移入10微升纯水的PCR反应管中，水中快速清洗3次，以100℃的水浴处理10分钟，然后取1微升进行PCR反应，以BOV97M(157bp，一种雄性牛的Y染色体的特异性基因断片)为雄性探针，以a-乳清蛋白基因片段(109bp)为雌性样品探针；PCR反应液的组成200微摩尔的脱氧核苷酸、各40微摩尔的雄性和雌性样品探针模板、1.25国际单位的DNA聚合酶(1.25Iu Taq聚合酶)、PCR缓冲液，用纯水将总液量调至50微升；PCR反应的条件95℃ 1分钟、55℃ 2分钟、72℃ 3分钟，上述条件重复40次；PCR反应样品检查取反应后的每个样品，以3％的琼脂糖电泳20分钟，具有157bp，109bp双带的胚胎为雄性，只有109bp带的胚胎为雌性，没有带的为样品操作失误或丢失。根据PCR的检查结果，就可以确定对应胚胎的性别，然后根据需要把胚胎进行移植或冷冻保存。此技术过程约需2-3小时，样品的处理可以重叠进行，胚胎的性别鉴定准确率约为100％。所说的荧光染色剂为Hoechst 33342。本专利技术具有以下优点分离精子的准确率达90％以上，精子活力保持在50％以上，胚胎的性别鉴定准确率约为100％。附图说明附图1是本专利技术工艺方法流程图。附图2是胚胎切割模型图和胚胎实际切割图。附图3是本专利技术染色体检查确认PCR结果图。具体实施例方式如图所示一种，包括以下步骤(1)精子分离和冷冻保存A、从正常种公牛采取新鲜精液1毫升，用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP，离心洗涤2次，2000转，5分钟，然后用所述的磷酸缓冲液把精子浓度调至100×106个/毫升，每毫升新鲜精液可调制10-15毫升上述浓度的稀释精液；B、在精子液中添加10微克/毫升荧光染色剂Hoechst 33342，在37℃的条件下DNA染色30分钟，然后用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP离心洗涤2次，2000转，5分钟；C、重新把精子浓度调至100×106个/毫升，然后装入流式细胞分离机内，以每秒钟3000个精子的速度进行分离，分开后的X精子带正电和Y精子带负电分别被回收后，按照每支250～500万个精子的总数，装入0.25毫升精液冷冻管，按照常规方法制成冷冻精液，保存于液化氮内，1毫升新鲜精液可以生产上述分离后的X精子或Y精子的冷冻精液各10-15支；D、生产性别控制胚胎由于胚胎的性别由受精时的精子型决定，因此利用分离后的X精子或Y精子直接生产试管胚胎，扩大分离精子的使用效率，具体方法是把分离后的精子以每支200个卵子的比例进行体外受精和培养，可以生产25-30个经过性别控制的A-B等级胚胎(囊胚)，冷冻保存，用于胚胎移植；(2)、胚胎性别鉴定A、胚胎性别鉴定以使用冷冻胚胎为主；B、胚胎细胞切割取解冻后的囊胚在所述的磷酸缓冲液加0.25％的蛋自酶中处理2-3分钟，使胚胎的透明带软化，然后移入所述的磷酸缓冲液加0.3％的血清蛋白溶液中，每次处理胚胎数20-40个左右；C、 在显微镜下，用刀端呈15°角，胚胎切割专用的金属刀片切下胚胎的营养层细胞10-15个，把切下的细胞和胚胎的主要部分，包括内胚团细胞，分别对应编号，胚胎的主要部分放入胚胎保存液TCM199-10％FBS中，在CO2培养箱中保留2-4小时；D、 以一种DNA体外合成技术PCR法对切下的细胞进行雌、雄性别鉴定，切取的每个胚胎细胞样品移入10微升纯水的PCR反应管中，水中快速清洗3次，以100℃的水浴处理10分钟，然后取1微升进行PCR反应；以BOV97M(157bp，一种雄性牛的Y染色体的特异性基因断片)为雄性探针，以a-乳清蛋白基因片段(109bp)为雌性样品探针；PCR反应液的组成200微摩尔的脱氧核苷酸、各40微摩尔的雄性和雌性样品探针模板、1.25国际单位的DNA聚合酶、PCR缓冲液，用纯水将总液量调至50微升；PCR反应的条件95℃ 1分钟、55℃ 2分钟、72℃ 3分钟，上述条件重复40次；PCR反应样品检查取反应后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法，其特征在于：包括以下步骤：　　　　（１）精子分离和冷冻保存：　　　　Ａ、从家畜体中采取新鲜精液１毫升，用磷酸缓冲液ＰＢＳ－０．０５％ＰＶＰ离心洗涤２次，２０００转，５分钟，然后用所述的磷酸缓冲液把精子浓度调至１００×１０↑［６］个／毫升，每毫升新鲜精液可调制１０－１５毫升上述浓度的稀释精液；　　　　Ｂ、在精液中添加１０微克／毫升荧光染色剂，在３７℃的条件下ＤＮＡ染色３０分钟，然后用磷酸缓冲液ＰＢＳ－０．０５％ＰＶＰ离心洗涤２次，２０００转，５分钟；　　　　Ｃ、重新把精子浓度调至１００×１０↑［６］个／毫升，然后装入流式细胞分离机内，以每秒钟３０００个精子的速度进行分离，分开后的Ｘ精子和Ｙ精子被回收后，按照每支２５０～５００万个精子的总数，装入０．２５毫升精液冷冻管，制成冷冻精液，保存于液化氮内，１毫升新鲜家畜精液生产上述分离后的Ｘ精子或Ｙ精子的冷冻精液各１０－１５支；　　　　Ｄ、生产性别控制胚胎：把分离后的精子以每支２００个卵子的比例进行体外受精和培养，生产２５－３０个经过性别控制的Ａ－Ｂ等级胚胎（囊胚），冷冻保存，用于胚胎移植；　　　　（２）胚胎性别鉴定：　　　　Ａ、使用上述的冷冻胚胎；　　　　Ｂ、胚胎细胞切割：取解冻后的囊胚在所述的磷酸缓冲液加０．２５％的蛋白酶中处理２－３分钟，使胚胎的透明带软化，然后移入所述的磷酸缓冲液加０．３％的血清蛋白溶液中，每次处理胚胎数２０－４０个左右；　　　　Ｃ、在显微镜下，用金属刀片或玻璃细针切下胚胎的营养层细胞１０－１５个，把切下的细胞和胚胎的主要部分，包括内胚团细胞，分别对应编号，胚胎的主要部分放入胚胎保存液ＴＣＭ１９９－１０％ＦＢＳ中，在ＣＯ↓［２］培养箱中保留２－４小时；　　　　Ｄ、以一种ＤＮＡ体外合成技术ＰＣＲ法对切下的细胞进行雌、雄性别鉴定，切取的每个胚胎细胞样品移入１０微升纯水的ＰＣＲ反应管中，水中快速清洗３次，以１００℃的水浴处理１０分钟，然后取１微升进行ＰＣＲ反应，以ＢＯＶ９７Ｍ为雄性探针，以α－乳清蛋白基因片段为雌性样品探针；　　　　ＰＣＲ反应液的组成：２００微摩尔的脱氧核苷酸、各４０微摩尔的雄性和雌性样品探针模板、１．２５国际单位的ＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ缓冲液，用纯水将总液量调至５０微升；　　　　ＰＣＲ反应的条件：９５℃　　１分钟、５５℃　　２分钟、７２℃　　３分钟，上述条件重复４０次；　　　　ＰＣＲ反...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：李喜和，
申请(专利权)人：李喜和，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]