牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法技术

本发明专利技术属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种牛早期胚胎的性别鉴定领域。其步骤是从待检牛胚胎中分离出４个或４个以上的细胞，用无菌超纯水冲洗后放入ＰＣＲ管中，加入适量无菌超纯水，煮沸，置于碎冰中，冷却后在低温下离心，取上清液液进行巢式ＰＣＲ反应，ＰＣＲ扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，得到电泳图谱，观察电泳图谱中是否同时出现５５８ｂｐ和２１９ｂｐ两条带，从而判别所检测的牛早期胚胎的性别。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种用于牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法，其特征在于下列步骤：　（１）试样的制备与保存　从待检牛胚胎中分离４个或４个以上的细胞，用无菌超纯水冲洗３次后，放入０．５ｍＬ　ＰＣＲ管中，加入１０μＬ无菌超纯水，１００℃煮沸１０ｍｉｎ ～１５ｍｉｎ，立即置于碎冰中，冷却后在８２２８×ｇ，４℃下离心５ｍｉｎ，取上清液保存于４℃冰箱中，备用；　（２）巢式ＰＣＲ反应　第一次ＰＣＲ反应：以ＳＲＹ１外引物和内参照ＨＢＢ引物扩增，体系为２０μＬ：０．８ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴ Ｐ、２Ｕ的Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、０．２μｍｏｌ／Ｌ的ＳＲＹ基因外引物ＳＲＹ１和内参照引物ＨＢＢ、１０×ＰＣＲ缓冲液、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｇＣｌ２，加适量双蒸水；反应程序为９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，２０个循环结束后，７２℃再延伸１０ｍｉｎ，４℃保温２ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；　第二次ＰＣＲ反应，以ＳＲＹ２外引物和内参照ＨＢＢ引物扩增，取第１次ＰＣＲ扩增产物８μＬ，作为第２次扩增模板，同时加入１０×ＰＣＲ缓冲液、２．５ｍｍｏｌ／ Ｌ的ＭｇＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ１．６μＬ，２Ｕ的ＴａｑＤＮＡ聚合酶、０．２μｍｏｌ／Ｌ的ＳＲＹ基因内引物ＳＲＹ２和内参照引物ＨＢＢ、适量的双蒸水至２０μＬ；反应程序为９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３４个循环后，７２℃再延伸１０ｍｉｎ，４℃保温２ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；　（３）ＰＣＲ扩增产物检测　取５μＬ　ＰＣＲ扩增产物，１．０％～１．５％琼脂糖凝胶电泳，所述的条件是：３Ｖ／ｃｍ～５Ｖ／ｃｍ，电泳２０ｍｉｎ～３ ０ｍｉｎ，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，得到电泳图谱；　检测电泳图谱中是否同时出现５５８ｂｐ和２１９ｂｐ两条带；　其中，步骤（２）所用的特异引物如下：　ＳＲＹ１外引物　正向：５′ＣＴＡＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＧＴＣＡ ＧＡＡＣ３′；　反向：５′ＡＧＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＴＡ３′；　ＳＲＹ２内引物　正向：５′ＣＣＡＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＡ３′；　反向：５′ＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＴＡＧＧＣＴＣＡＡ３′；　ＨＢ Ｂ内参照引物　正向：５′ＴＡＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＴＴ３′；　反向：５′ＧＣＡＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＡ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡修忠，李翔，刘辉，刘文举，吴俊静，杨利国，易建明，余勇，张淑君，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]