SRY抗体的应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞工程技术领域，具体的说是涉及SRY抗体在制备控制哺乳动物胚胎性别的产品中的应用及一种体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法。本发明专利技术利用SRY抗体处理雄性哺乳动物精液，SRY抗体能单一的作用于Y精子携带的SRY蛋白，使Y精子活力降低或干扰Y精子与卵母细胞识别和结合能力，但是对X精子的功能没有影响，使所得胚胎的性别大部分为雌性，从而达到生产雌性胚胎的目的。本发明专利技术属于免疫学方法，简便、快捷，对精子损害小，效率高，减少了非所需要的性别的胚胎，避免胚胎废弃造成浪费，适合于规模化养殖。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞工程
，具体的说是涉及SRY抗体的应用。技术背景性别控制(sex control)是指通过人为的干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。性别控制是一项能显著提高养殖业经济效益的生物工程技术。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益。其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。通过控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害。哺乳动物性别控制的方法多种多样，主要可分为两种受精前性别控制和受精后性别控制。受精前的性别控制主要是通过X、Y精子的分离来实现的，例如利用流式细胞仪分离精子；受精后的性别控制主要是利用生物学和非生物学方法进行性别鉴定后通过移植已知性别的胚胎达到控制后代性别比例，如核型分析法、X-相关酶法、DNA探针法、荧光原位杂交、LAMP法等。但最有效的方法是通过分离X、Y精子和鉴定早期胚胎的性别来控制后代的性别。分离X、Y精子并用于人工授精或显微授精是控制家畜性别最简单、可行的方法。 Χ、γ精子分离主要是依据两类精子理化特性的不同而进行的。关于这方面国外科技工作者进行了多方面研究，发现X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。Ke-hui Cui (1997)证实X、精子在长度、头部面积、周径、颈部长度、尾长等形态上显著大于Y精子，从而为分离精子提供了依据。根据两类精子理化特征上的细微差异，人们设计了诸如沉降法、离心法、过滤法、 电泳法等来分离X、Y精子，并有控制性别比例的报道，但许多研究结果的可重复性很差，并且后代出生的性别比例并没有明显超出自然出现的性别比例范围，实际生产中推广的意义不大。近年来发展起来的细胞流式分类器和免疫学方法在分离两类精子的效率上显示出较大的优势。Johnson (1994)研究表明X与Y精子在染色体的DNA组成上存在最高可达12. 5% 差别，依据这一原则设计出的流式细胞分类器可将X与Y精子分开并进行体外受精，已获得预期性别的牛、兔、猪、绵羊的活后代。目前流式细胞分类器分离X、Y精子是所有方法中效率最高的，日本已将该法做为实施性别控制技术的基础。但此法分离速度很慢，同时精子分离操作过程中，有些步骤还会对精子产生损害作用，如高浓度的荧光染色剂、激光照射、极高的流速、高稀释倍数和离心力等，且仪器价格昂贵，直接限制了其应用范围。应用免疫学方法分离精子是从Eictwald和Silmser发现雄性特异性弱组织相容性 Y抗原(male specific minor histocmpatibility-Y anti-gen)，简称 H-Y抗原，后逐渐发展起来的。现已证明H-Y抗原被保留在整个进化过程中，除了某些过渡品种外，在所有异配子型性别品种的体细胞中均发现H-Y抗原存在。许多实验都证实，只有Y精子才能表达H-Y抗原，因而，利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，再通过一定的分离程序，就能将精子分离成为H-Y+(Y精子)和Η-Γ(Χ精子)两类。将所需性别的精子进行人工授精， 即可获得预期性别的后代。Η-Υ+、Η-Γ精子分离的主要方法有免疫亲和柱层析法、直接分离法及免疫磁力法。Bradley (1989)用免疫亲和柱层析法分离绵羊的H-Y+和H_Y_精子，发现不被层析柱上而后被洗脱下来的有70 % 80 %为Η-Γ，结合到层析柱上而后被洗脱下来的有75 % 80 %的H-Y+，对照组有43 % 44 %为H-Y+，56 % 57 %为H_Y_。虽然该法分离精子的效率较高，然而经处理后的精子数目少而且活力低，很难在实际生产中应用。早期胚胎的性别鉴定也是实现性别控制的主要途径之一，包括核型分析法、X染色体连接酶活力测定法、H-Y抗原法(包括细胞毒性分析法和间接免疫荧光法)以及针对性别决定区特定基因序列的聚合酶链式反应(PCR)方法和荧光原位杂交技术(FISH)。以上这些早期胚胎性别鉴定技术业已成熟，但这些方法要么准确率不高、要么费时，而且必须利用胚胎移植技术，不适宜在实际生产中应用推广。而且由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上取下少量细胞，因而性别鉴定的胚胎经冷冻-解冻处理仅有少量胚胎存活，导致胚胎移植的成功率下降。其次，性别鉴定的胚胎需反复转移胚胎，再移植的胚胎其成活率降低。再次， 不论怎样进行胚胎的性别鉴定，按照生态平衡原理所产生的雌雄胚胎比例总是1 1，在移植时，所需要的性别的胚胎被保留下来，而另一半因没有用处被扔掉，造成胚胎的浪费，不适合规模化养殖。因此建立一种快速、准确的，尽量减少对胚胎产生损害的非侵害性方法以控制早期胚胎性别具有十分重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的是提供一种SRY抗体的新应用及一种对胚胎损害小、效率高的体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法。性别形成的机理是进行性别控制的基础。早期研究证实了人类X和Y染色体的存在，指出当卵子与X精子受精，后代为雌性，Y精子受精，后代为雄性。哺乳动物胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，但已具备了有分化潜能的生殖器官的原始胚基。如果性染色体为XX，那么性腺原基发育为卵巢，个体为雌性；如果性染色体为XY，那么性腺原基发育为睾丸，个体为雄性。家畜性别的分化则是在性染色体基因和常染色体性别相关基因的复杂作用下的最终结果。研究表明，Y染色体的性别决定区(sex determining region of the Y, Sry)即为性别决定因子。性别发育以Sry基因为核心，Sry基因在胚胎发育的早期开始表达。哺乳动物的SRY基因是含有DNA结合基序(HMG盒)的睾丸决定基因，为单拷贝，编码有大约 78个氨基酸的HMG盒，从有袋动物到胎生动物都是保守的。SRY基因的表达与肇丸分化密切相关，SRY转基因XX小鼠发育成雄性。Sry基因编码的SRY蛋白的结合活性位于HMG盒中，这个结构域的突变与XY雌性个体的性逆转有关。SRY抗体是哺乳动物机体的免疫系统在SRY蛋白抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与SRY蛋白抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。利用SRY抗体处理雄性哺乳动物精液，SRY抗体能单一的作用于Y精子携带的SRY蛋白，使Y 精子活力降低或干扰Y精子与卵母细胞的识别和结合能力，但是对X精子没有影响，使所得胚胎的性别大部分为雌性，从而达到控制胚胎性别的目的。实验表明，经胚胎性别鉴定，采用SRY抗体处理的牛精液进行体外受精，所得到的牛胚胎雌雄比例可达到75 82%。因此本专利技术提供了 SRY抗体在制备控制哺乳动物胚胎性别的产品中的应用。其中，所述哺乳动物可以为牛、猪、羊、马、兔或狗。本专利技术还提供了一种对胚胎损害小、效率高的体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法。一种体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法，将新鲜的或冷冻解冻的雄性哺乳动物精液缓慢注入2mL含有SRY抗体的受精液底部孵育，然后取上清置于离心管中离心，取沉淀用受精液洗涤，注入含有成熟卵母细胞的受精滴中进行体外受精培养，培养24h后将胚胎移入胚胎培养液中，继续培养即得；其中，所述受精液配方为NaCl 6. 66g/L、KCl 0. 238g/L、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周虚，李纯锦，刘卓，陈璐，
申请(专利权)人：周虚，
类型：发明
国别省市：