一种源于光敏色素的黄色荧光标记物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种源于光敏色素的黄色荧光标记物的制备方法，融合蛋白包括蓝细菌光敏色素蛋白all2699的第3个GAF结构域和链霉亲和素。本发明专利技术的融合蛋白序列，易于在微生物中稳定表达，规避了高纯度天然藻胆蛋白和蓝细菌光敏色素的获取困难，制备成本较高；化学修饰剂的使用；天然藻胆蛋白聚合形态不稳定等缺点。本发明专利技术的表达方法，无需藻胆蛋白裂合酶参与，减少转化的基因数量，提高菌种稳定性和筛选效率。同时通过优化发酵培养基和发酵条件，大大提高了融合蛋白的产量。

Preparation of a yellow fluorescent marker derived from phytochrome

The present invention discloses a preparation method of a yellow fluorescent marker derived from photosensitive pigment, which includes third GAF domains of the cyanobacteria photosensitive pigment protein all2699 and streptomycin. The fusion protein sequence of the invention is easy to be expressed steadily in microbes, avoiding the difficulty in obtaining high purity natural algin and cyanobacteria, the preparation cost is high, the use of chemical modifier, and the instability of the polymerization form of natural algal protein. The expression method of the invention does not require the participation of the algal protein cleavage enzyme, reduces the number of transformed genes, and improves the stability and screening efficiency of the strain. At the same time, the yield of fusion protein was greatly improved by optimizing fermentation medium and fermentation conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种源于光敏色素的黄色荧光标记物的制备方法
本专利技术涉及融合蛋白表达领域，特别涉及一种光敏色素荧光标记物的制备方法。
技术介绍
荧光探针(或荧光标记物)是荧光免疫检测技术的重要基础原料，主要是通过化学修饰法，将荧光底物同生物素-链霉亲和素系统结合得到，可进一步放大荧光信号，提高免疫检测的灵敏度。天然藻胆蛋白是最常见的荧光底物之一，其天然结构一般为六聚体，亚基由脱辅基蛋白和藻胆色素，通过裂合酶催化结合而成。藻胆色素则由血红素经过血红素氧化酶(HO1)和各种胆绿素还原酶催化形成，常见的藻胆色素有藻红胆素(PEB)，藻尿胆素(PUB)，藻蓝胆素(PCB)和藻紫胆素(PVB)。通过结合不同的藻胆色素，藻胆蛋白吸收400nm～700nm范围内不同波段的光后，可发出不同的荧光。传统的藻胆蛋白荧光探针制备流程，首先是获取高纯度天然藻胆蛋白，然后通过化学修饰法，与生物素-链霉亲和素系统结合，进一步纯化后再用于免疫检测。但是高纯度的天然藻胆蛋白获取困难，制备成本高，同时结构不稳定，聚合形态多变。这使得藻胆蛋白荧光探针的成本居高不下。通过微生物表达融合蛋白是一种成本较低的蛋白制备方法。然而融合蛋白的表达往往受到融合基因的设计和发酵工艺的限制，并不能稳定的表达，难以得到质量稳定的合格产品。如何选择合适的蛋白片断进行融合，使其可以更为稳定地发酵生产，是有待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种易于表达的融合蛋白序列及其表达方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种融合蛋白，其包括蓝细菌光敏色素蛋白all2699的第3个GAF结构域和链霉亲和素。作为上述融合蛋白的进一步改进，融合蛋白中还添加有亲和标记。作为上述融合蛋白的进一步改进，融合蛋白的序列为：MGSSHHHHHHSQDPEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGESLDTNTIFQITTKEACQLIKADRVSVYRFDNEWGGEFVGDFEATSPHWSNESKISINTVWNDTYLQNTQGGRYRYNETFAVDDIYKVGFTQCHVENLEQFQIYAFVLAPIFVGQKLWGLLATYQHSGPRQWKPSEVNFLTQIAAQLGIALQQAELLNQTQQQ。表达上述融合蛋白的核苷酸序列。进一步的，核苷酸序列根据宿主菌进行密码子优化。插入有上述核苷酸序列的质粒。作为上述质粒的进一步改进，质粒为pETDuet载体质粒，核苷酸序列通过酶切位点BamHⅠ、EcoRⅠ插入pETDuet载体质粒的多克隆位点1。一种融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：1)根据上述融合蛋白的序列，设计得到融合蛋白基因序列；2)将融合蛋白基因序列插入到质粒中，得到融合蛋白质粒；3)将融合蛋白质粒和表达藻红胆素合成的相关基因：血红素氧化酶基因ho1，胆绿素还原酶基因pebS的质粒共转入大肠杆菌，得到基因工程菌；4)使用三级接种方法在培养基中接种基因工程菌，37℃发酵培养至生长前期；5)降温至20℃，培养0.8～1.2h；6)升温至25℃，加入终质量浓度为1.3～1.6％的乳糖诱导培养14～16h；7)收集菌体提取、纯化得到融合蛋白。作为上述制备方法的进一步改进，发酵培养基的质量组成为：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，甘油0.4％，0.004％～0.04％猪血球蛋白粉或血红素，余量为水，pH值调至7.2。作为上述制备方法的进一步改进，加入终质量浓度为1.5％的乳糖诱导培养。本专利技术的有益效果是：本专利技术的融合蛋白序列，易于在微生物中稳定表达，规避了高纯度天然藻胆蛋白和蓝细菌光敏色素的获取困难，制备成本较高；化学修饰剂的使用；天然藻胆蛋白聚合形态不稳定等缺点。本专利技术的表达方法，无需藻胆蛋白裂合酶参与，减少转化的基因数量，提高菌种稳定性和筛选效率。同时通过优化发酵培养基和发酵条件，大大提高了融合蛋白的产量。附图说明图1是光敏色素荧光标记物的光谱特征图；图2是光敏色素荧光标记物(对照)的光谱特征图；图3是不同发酵培养基的发酵效果对比。具体实施方式下面结合实施例，进一步说明本专利技术的技术方案。实施例1蓝细菌光敏色素GAF结构域序列的选取蓝细菌光敏色素基因序列all2699(藻种PCC7120)，存在有3个同源性较高的GAF结构域，本方案选取的GAF结构域基因序列为第3个结构域基因序列，以下称为gaf基因序列。其表达后的蛋白质氨基酸序列如下：ESLDTNTIFQITTKEACQLIKADRVSVYRFDNEWGGEFVGDFEATSPHWSNESKISINTVWNDTYLQNTQGGRYRYNETFAVDDIYKVGFTQCHVENLEQFQIYAFVLAPIFVGQKLWGLLATYQHSGPRQWKPSEVNFLTQIAAQLGIALQQAELLNQTQQQ(SEQIDNO：1)。转基因质粒组合的选择本方案采用Duet系列双质粒组合，sa::gaf融合基因接入pETDuet的多克隆位点1；藻红胆素合成酶质粒采用pACYCDuet-ho1-pebS。链霉亲和素sa序列与gaf序列，6his-taq亲和标记序列进行融合设计，并针对大肠杆菌表达系统进行基因序列优化。最终sa::gaf基因序列所表达的融合蛋白质氨基酸序列如下：MGSSHHHHHHSQDPEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGESLDTNTIFQITTKEACQLIKADRVSVYRFDNEWGGEFVGDFEATSPHWSNESKISINTVWNDTYLQNTQGGRYRYNETFAVDDIYKVGFTQCHVENLEQFQIYAFVLAPIFVGQKLWGLLATYQHSGPRQWKPSEVNFLTQIAAQLGIALQQAELLNQTQQQ(SEQIDNO：2)。融合后的基因序列通过酶切位点BamHⅠ(GGATCC),EcoRⅠ(GAATTC)接入pETDuet载体质粒的多克隆位点1(MCS1)，得到质粒pETDuet-sa::gaf。菌种制备筛选1)从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mLLB培养基，37℃振荡培养过夜；2)取100μL饱和培养物，无菌转接至5mLLB培养基，37℃振荡培养至OD600＝0.3～0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min；离心1min(10000g，4℃)弃去上清，收集沉淀菌体；3)用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s(10000g，4℃)去上清，菌体沉淀用100μL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30min，42℃热休克90s，冰浴5min后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其包括蓝细菌光敏色素蛋白all2699的第3个GAF结构域和链霉亲和素。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其包括蓝细菌光敏色素蛋白all2699的第3个GAF结构域和链霉亲和素。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：融合蛋白中还添加有亲和标记。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：融合蛋白的序列为：MGSSHHHHHHSQDPEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGESLDTNTIFQITTKEACQLIKADRVSVYRFDNEWGGEFVGDFEATSPHWSNESKISINTVWNDTYLQNTQGGRYRYNETFAVDDIYKVGFTQCHVENLEQFQIYAFVLAPIFVGQKLWGLLATYQHSGPRQWKPSEVNFLTQIAAQLGIALQQAELLNQTQQQ。4.表达权利要求1或2所述融合蛋白的核苷酸序列。5.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于：核苷酸序列根据宿主菌进行密码子优化。6.插入有...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴明，卢艳华，陈彦蓉，夏坤，佟顺刚，
申请(专利权)人：广州天宝颂原生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44