非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原及其制备方法和用途，通过生物信息学软件对ASFV重要结构蛋白基因编码氨基酸的序列进行分析筛选重组，构建并合成多表位融合抗原基因并在大肠杆菌中进行表达，经筛选获得重组多表位融合抗原ASFV‑meAg6，为ASFV血清学诊断方法提供了一个特异性强和敏感性高的诊断抗原蛋白。

Multi epitope fusion diagnostic antigen of African swine fever virus and preparation method and use thereof

The present invention discloses an African swine fever virus multi epitope fusion diagnostic antigen and its preparation method and use. Through bioinformatics software, the sequence of ASFV important structural protein gene encoding amino acid is analyzed and recombinant, and multi epitope fusion antigen gene is constructed and synthesized and expressed in Escherichia coli. The recombinant epitope fusion antigen, ASFV meAg6, has been recombined to provide a highly specific and sensitive diagnostic antigen protein for ASFV serological diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒(ASFV)多表位融合诊断抗原ASFV-meAg6及其制备方法和用途，属生物

技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)所引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病毒可感染所有品种和年龄的猪，在临床上病猪以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为特征，死亡率高达100％。该病在我国被列为一类动物疫病，属于世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病。ASF最初主要在非洲和欧洲东部流行，随后在非洲以外的意大利撒丁岛、西班牙、葡萄牙、加勒比地区、巴西以及东欧等国家或地区发现。2007年，该病传入俄罗斯后不断蔓延，已经传播至俄罗斯的46个地区。2017年3月，与我国接壤的俄罗斯远东地区发生ASF疫情，使得该病传入我国的风险不断增加，因此我国急需提高对该病的检测和监测能力。非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)为一种含有囊膜的双链DNA，基因组为线性双链DNA，长度在170～190kb之间，可编码151个蛋白。该病毒是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfarvirus)的唯一成员，目前只有1个血清型，但不同地区ASFV分离株基因组存在一定的差异。根据P72基因遗传进化分析，目前可将ASFV分为23个基因型。在临床上，由于ASF主要以高热和内脏器官出血为主要特征，与猪瘟(CSF)非常相似，因此无法通过临床症状和病理变化进行鉴别诊断，只有依赖于实验室进行确诊。目前，ASF的实验室诊断包括动物接种、病毒分离、病毒核酸DNA检测和特异性抗体检测等方法。然而，动物接种、病毒分离、病毒核酸DNA检测方法或需要在生物安全三级以上的实验室，或需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，或操作繁琐的试验程序以及较长的检测时间，难以满足基层临床检测需要。由于ASF没有疫苗，因此当前ASF的实验室诊断方法主要以检测特异性抗体为主。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用于血清抗体的检测方法，具有操作方便，特异性较好，灵敏度高，适用于大批量样品的检测。PerezFilgueira等人采用了间接ELISA法对ASFV感染猪的血清样品进行了检测，证实该方法具有敏感性高的优点，能够检测出ASFV早期感染的样品，可以用于ASFV早期特异性抗体的检测。Vidal等人建立了检测ASFV抗体的固相ELISA，其检测血清样品的敏感性达0.05mg/ml。Hutchings等建立了间接夹心ELISA，试验表明其敏感性高于单抗酶联免疫吸附试验。西班牙某公司已经研制出阻断ELISA检测试剂盒，并且已经商品化，也是目前世界动物卫生组织指定的参考试剂盒，该试剂盒的敏感性和特异性较好，但由于价格昂贵，限制在发展中国家中广泛应用。国内有学者以P72纯化蛋白为包被抗原，建立了间接ELISA来检测非洲猪瘟病毒血清抗体。然而，目前国内尚没有商品化的试剂盒。ASFV血清学检测是诊断动物感染ASFV的重要方法之一。因此筛选和鉴定特异性高和反应原性强的ASFV抗原是研发ASFV诊断试剂的关键。在现有的ASFVELISA检测方法中，所使用的ASFV诊断抗原或为细胞培养的全病毒抗原，或为ASFV单一的重组蛋白。然而，研究表明，细胞培养的全病毒抗原虽然敏感性较高，但其特异性较低；单一重组蛋白抗原虽具有较高的特异性，但敏感性不高。因此，有必要研发和制备高特异性和敏感性的ASFV诊断抗原。一种具有高特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(ASFV)多表位融合诊断抗原ASFV-meAg6及其制备方法和用途就应运而生。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有高特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(ASFV)多表位融合诊断抗原ASFV-meAg6及其制备方法和用途。目前的研究发现，在ASFV结构蛋白中，p72、p54、p22、p12、p17、p30、p14.5、p150、p37、p34及p14等结构蛋白具有较强的免疫原性和反应原性。本专利技术通过生物信息学软件对ASFV重要结构蛋白P72、P54、P30和P12基因编码氨基酸的序列进行分析，将筛选得到的优势抗原表位采用柔性氨基酸按照一定顺序进行串联，构建并合成多表位融合抗原(ASFV-meAg)基因，在大肠杆菌中进行表达，通过血清学试验筛选获得具有强反应原性的重组ASFV-meAg。将纯化的重组ASFV-meAg作为包被抗原建立间接ELISA方法，经对血清样品进行检测，与商品化的检测试剂盒进行结果对比，证实所制备的重组多表位融合抗原ASFV-meAg6具有高特异性和敏感性，为ASFV血清学诊断方法提供了一种特异性强和敏感性高的诊断抗原蛋白。即<210>3。本专利技术的非洲猪瘟病毒(ASFV)多表位融合诊断抗原ASFV-meAg6，即<210>3主要通过以下过程制备：1、ASFV重要结构蛋白优势抗原表位的预测分析2、ASFV-meAg多表位融合抗原基因的构建方法3、ASFV-meAg基因在大肠杆菌中的表达4、ASFV-meAg6抗原蛋白的纯化5、基于ASFV-meAg6抗原蛋白建立间接ELISA方法及条件的优化6、ASFV-meAg6-ELISA法与商品化ASFV间接ELISA方法的检测结果的比对具体如下：1、ASFV重要抗原基因优势抗原表位的预测分析。根据ASFV全基因组序列对ASFV重要抗原基因(P72、P54、P30和P12)所编码氨基酸序列的抗原表位进行预测分析，综合四种不同的预测方法寻找出存在共同优势线性抗原表位的序列(表1)。2、ASFV多表位融合抗原基因的构建。通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸序列(GGCCCGGGC)将编码优势抗原表位的基因按照一定的排列组合串联在一起，构建了6个含有多表位的融合抗原基因(命名为ASFV-meAg1-6)。经过稀有密码子在线软件(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)对融合基因ASFV-meAg1-6中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌稀有密码子，以易于重组蛋白在大肠杆菌中表达。通过上述不同的排列组合方式构建ASFV多表位融合抗原蛋白基因。3、ASFV多表位融合抗原(ASFV-meAg)基因在大肠杆菌中的表达。通过标准的分子克隆技术构建pT-ASFV-meAg重组质粒，采用EcoRI和XhoI分别对pT-ASFV-meAg质粒和pET-28a(+)质粒进行双酶切，采用T4DNA连接酶构建一个pET-ASFV-meAg重组质粒。将该质粒转入感受态细胞E.coliDH5α中，涂布于含有Kan抗性的固体LB平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，将筛选的阳性菌进行测序。将鉴定正确的pET-ASFV-meAg重组表达质粒转化表达工程菌E.coliBL21，37℃培养12h，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有卡那霉素的液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原的核苷酸序列为：<210>3。

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原的核苷酸序列为：&lt;210&gt;3。2.一种非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原的制备方法，其特征在于，主要包含以下过程：ASFV重要抗原基因优势抗原表位的预测分析：根据ASFV全基因组序列，利用生物在线软件ABCPred及DNAStar-Protean软件分别对ASFV重要抗原基因(P72、P54、P30和P12)所编码氨基酸序列的抗原表位进行预测分析，综合不同的预测方法寻找出每个抗原蛋白共同的优势线性抗原表位序列；ASFV多表位融合抗原基因的构建：通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸序列(GGCCCGGGC)将编码优势抗原表位的基因按照一定的排列组合串联在一起，构建含有多表位的融合抗原基因；对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌稀有密码子，通过不同的排列组合方式构建若干个ASFV多表位融合抗原蛋白基因；ASFV多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达：通过标准的分子克隆技术构建pT-ASFV-meAg重组质粒，分别对pT-ASFV-meAg质粒和pET-28a(+)质粒进行双酶切，连接酶构建一个pET-ASFV-meAg重组质粒，将该质粒转入感受态细胞E.coliDH5α中，培养后，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，将筛选的阳性菌进行测序，将鉴定正确的pET-ASFV-meAg重组表达质粒转化表达工程菌E.coliBL21并培养，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有卡那霉素的液体LB培养基中，培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照分析，根据分析结果找到反应原性最强的蛋白。3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原的制备方法，其特征在于，所述ASFV多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达为：通过标准的分子克隆技术构建pT-ASFV-meAg重组质粒，采用EcoRI和XhoI分别对pT-ASFV-meAg质粒和pET-28a(+)质粒进行双酶切，采用T4DNA连接酶构建一个pET-ASFV-meAg重组质粒，将该质粒转入感受态细胞E.coliDH5α中，涂布于含有Kan抗性的固体LB平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，将筛选的阳性菌进行测序，将鉴定正确的pET-ASFV-...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔军，孟庆玲，郭晶，李杰，乔梦凡，张星星，李重阳，孟丹，伍晔晖，王熙凤，贡莎莎，蔡扩军，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65