一种羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针，本发明专利技术提供的羧酸酯酶荧光探针是具有萘核双光子吸收单元和D‑π‑A结构的半花菁类化合物，具有双光子吸收和发射特性，能够应用于检测细胞内羧酸酯酶。实施例的实验结果表明，本发明专利技术提供的羧酸酯酶荧光探针能够延长细胞和组织中检测羧酸酯酶的激发波长(800nm)，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度；同时，本发明专利技术提供的羧酸酯酶荧光探针检测羧酸酯酶时稳定性强，响应时间短(为7min)，对pH不敏感，对细胞内羧酸酯酶成像具有特异性，能够在双光子激发条件下在活细胞中检测羧酸酯酶。 1

Carboxylesterase fluorescent probe and preparation method and application thereof

The present invention provides a carboxylic esterase fluorescent probe with the structure of I. The carboxylesterase fluorescent probe provided by the invention is a semi flower cyanine compound with a two photon absorption unit of naphthalene nucleus and a A structure of D, which has two photon absorption and emission characteristics and can be applied to the detection of intracellular carboxylic acid esterase. The experimental results show that the carboxylesterase fluorescent probe provided by the invention can prolong the detection of the excitation wavelength (800nm) of the carboxylic esterase in cells and tissues, reduce the light damage to cells and tissues, increase the depth of tissue penetration and imaging depth; meanwhile, the carboxylesterase fluorescent probe for the present invention is used to detect carboxylic acid esterase. It has strong stability, short response time (7min), insensitive to pH and specific to intracellular carboxylesterase imaging, and can detect carboxylesterase in living cells under two-photon excitation. One

【技术实现步骤摘要】
一种羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物化学材料
，尤其涉及一种羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
哺乳动物羧酸酯酶(Carboxylesterase，CaE，E.C.3.1.1.1)也叫脂族酯酶，广泛分布于哺乳动物组织和器官中，其活性中心含丝氨酸残基，能够有效的催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解。哺乳动物羧酸酯酶的主要功能可能是参与脂质运输和代谢，催化一些内源性化合物，如短链和长链酰基丙三醇、长链酰基肉毒碱和长链酰基CoA酯的水解；以及参与信号跨膜传导及保持生物膜完整性；催化药物(包括前体药物)生成相应的自由酸，参与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢。人体内羧酸酯酶主要有hCE1和hCE2两种类型，hCE1主要存在于肝脏中，hCE2主要存在于肠道中。hCE1主要催化水解一大类外源性或内源性的底物，如脂肪酸、环境毒物和药物等，参与许多重要的生理过程，如脂质体内平衡、睾酮生成、视黄醇代谢、内质网中蛋白质的跟踪和保留等。人体内缺乏hCE1会导致多种疾病，如动脉粥样硬化、肝脂质沉着症、肥胖、高血脂以及肝癌等。另外近期研究发现，羧酸酯酶可以作为肝癌的血清标志物之一。基于羧酸酯酶的重要生理作用，检测羧酸酯酶及其活性对许多生理过程的研究及药物的疗效评价具有非常重要的科学意义和实际应用价值。传统检测羧酸酯酶的方法有高效液相色谱法、气质联用、化学发光法及荧光法等，其中，荧光法由于具有操作简单、灵敏度高、检测限低、可用于细胞内或活体成像等优点受到了科学家们的广泛关注。目前文献报道的检测羧酸酯酶的荧光探针中，大部分存在对pH较敏感、在细胞培养液中稳定性差、细胞穿透能力差、无法应用于活细胞或组织中成像等缺点。此外，已有可用于细胞成像的羧酸酯酶荧光探针在细胞成像中所需要的激发波长较短(<500nm)，短波长的激发光容易导致细胞光损伤，产生活性氧物质，并且组织穿透深度和成像深度较浅，限制了其在活细胞和活体成像中的应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用，本专利技术提供的羧酸酯酶荧光探针能够在双光子激发条件下在活细胞中检测羧酸酯酶。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种羧酸酯酶荧光探针，具有式I所示结构：式I中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。优选的，所述烷基、烷氧基和烷氨基中碳原子个数独立地为1～6。优选的，所述芳基、芳氧基和芳氨基中芳基个数独立地为1～2。优选的，所述羧酸酯酶荧光探针包括本专利技术提供了上述技术方案所述羧酸酯酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物；(2)将所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物、有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针；式II和式III中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。优选的，所述步骤(1)中具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂的混合是将乙酰氯加入到具有式II所示结构的化合物、碱性试剂和有机溶剂的混合溶液中。优选的，所述乙酰氯的加入方式为滴加；所述滴加在-2～2℃的条件下进行。优选的，所述步骤(2)中缩合反应的温度为75～85℃；缩合反应的时间为14～18h。本专利技术提供了上述技术方案所述羧酸酯酶荧光探针在检测羧酸酯酶中的应用。优选的，所述羧酸酯酶为人宫颈癌细胞内的羧酸酯酶。本专利技术提供了一种具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针，本专利技术提供的羧酸酯酶荧光探针是具有萘核双光子吸收单元和D-π-A结构的半花菁类化合物，具有双光子吸收和发射特性，能够应用于检测细胞内羧酸酯酶。实施例的实验结果表明，本专利技术提供的羧酸酯酶荧光探针能够延长细胞和组织中检测羧酸酯酶的激发波长(800nm)，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度；同时，本专利技术提供的羧酸酯酶荧光探针检测羧酸酯酶时稳定性强(在37℃时的PBS溶液中孵化60min荧光强度保持不变)，响应时间短(为7min)，对pH不敏感，对细胞内羧酸酯酶成像具有特异性，能够在双光子激发条件下在活细胞中检测羧酸酯酶。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为HCyNAc在PBS缓冲溶液中37℃下孵化不同时间后荧光强度的变化图；图2为HCyNAc在不同pH值的PBS缓冲溶液中荧光强度的变化图；图3为HCyNAc在不同浓度的羧酸酯酶存在条件下的PBS缓冲溶液中37℃下孵化不同时间后荧光强度的变化图；图4为在10μM的HCyNAc溶液中加入不同浓度羧酸酯酶孵化后荧光发射光谱的变化图；图5为10μM的HCyNAc溶液在567nm处荧光强度与羧酸酯酶浓度的关系及线性曲线图；图6为在10μM的HCyNAc溶液中分别加入不同竞争分子后的荧光强度变化图和在10μM的HCyNAc溶液中分别加入不同竞争分子后再加入0.05U/mL的羧酸酯酶的荧光强度变化图；图7为HCyNAc在抑制剂双(4-硝基苯基)磷酸酯存在条件下对羧酸酯酶的荧光响应情况图；图8为羟基化合物HCyN在不同功率820nm双光子激发条件下的发射光谱图；图9为HCyN荧光输出光谱积分面积与输入功率的对数关系图；图10为HCyNAc与HeLa细胞37℃下孵化15min后的单光子或双光子激光共聚焦显微成像照片。具体实施方式本专利技术提供了一种羧酸酯酶荧光探针，具有式I所示结构：式I中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。在本专利技术中，所述烷基、烷氧基和烷氨基中碳原子个数优选独立地为1～6。在本专利技术中，所述芳基、芳氧基和芳氨基中芳基个数优选独立地为1～2。在本专利技术中，所述羧酸酯酶荧光探针优选包括本专利技术提供了上述技术方案所述羧酸酯酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物；(2)将所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物、有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针；式II和式III中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。本专利技术将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物。在本专利技术中，所述具有式II所示结构的化合物、乙酰氯和碱性试剂的摩尔比优选为1：(1.0～1.2)：(1～1.4)，更优选为1：1：1.2。本专利技术对于所述碱性试剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行乙酰化反应的碱性试剂即可，具体如三乙胺或吡啶。本专利技术对于所述有机溶剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行乙酰化反应的有机溶剂即可；具体如二氯甲烷或四氢呋喃。在本专利技术中，所述具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂的混合优选是将乙酰氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羧酸酯酶荧光探针，具有式I所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种羧酸酯酶荧光探针，具有式I所示结构：式I中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。2.根据权利要求1所述的羧酸酯酶荧光探针，其特征在于，所述烷基、烷氧基和烷氨基中碳原子个数独立地为1～6。3.根据权利要求1所述的羧酸酯酶荧光探针，其特征在于，所述芳基、芳氧基和芳氨基中芳基个数独立地为1～2。4.根据权利要求1～3任一项所述的羧酸酯酶荧光探针，其特征在于，包括5.权利要求1～4任一项所述羧酸酯酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物；(2)将所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物、有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建国，姜国玉，陈青青，李勋，范小林，
申请(专利权)人：赣南师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36