本发明专利技术提供一种重组腺相关病毒介导的治疗高脂血症和动脉粥样硬化的基因治疗药物。重组腺相关病毒载体携带优化的人卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶（optimized Lecithin‑cholesterol acyltransferase,optLCAT）基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达LCAT蛋白，催化HDL中的胆固醇酯化，提高体内的HDL浓度，降低甘油三酯（TG）含量，显著降低动脉粥样硬化的发病率。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的治疗高脂血症和动脉粥样硬化的基因治疗药物。
【技术实现步骤摘要】
一种腺相关病毒介导的LCAT基因表达载体及其用途
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带LCAT基因表达框的治疗高脂血症和预防动脉粥样硬化的基因药物。
技术介绍
卵磷脂胆固醇酰基转移酶（lecithincholesterolacyltransferase,LCAT）是由Glomset等人（GlomsetJA.BiochimBiophysActa.1962;19(65):128-135.）于1962年分离并命名的。LCAT在肝脏中合成，后分泌释放入血液，在血浆中以游离形式或以与脂蛋白结合形式存在，是血浆脂蛋白代谢的一种关键酶，对维持胆固醇稳态及调节血液循环中胆固醇转运具有十分重要的作用。人类LCAT基因位于人的第16号染色体长臂q22上，包含6个外显子和5个内含子，全长大约4200bp。LCAT基因主要在肝脏中表达，少部分表达于大脑和睾丸（CalabresiL,etal.ArteriosclerThrombVascBiol.2005;25(9):1972-1978.）。编码LCAT的信使RNA长约1500bp，其信号肽由440个氨基酸组成。人的成熟LCAT是由416个氨基酸残基组成的分泌蛋白，属于糖蛋白，其中糖链约占24%，是维持其活性必不可少的组分。血浆胆固醇几乎70~80%是胆固醇酯，均是由LCAT催化生成。LCAT对HDL的代谢具有重要作用，其表达水平与HDL-C呈正相关，与三酰甘油呈负相关，LCAT活性和水平的改变都将影响HDL的成熟代谢过程（CalabresiL,etal.JLipidRes.2011;52(8):1569-1574.）。LCAT主要是催化HDL的游离胆固醇酯化，促使新生的小球状或盘状的HDL3转化为成熟的球状HDL2，从而使HDL经前β1-HDL→HDL3→HDL2的过程逐渐成熟。由于胆固醇酯比游离胆固醇疏水作用更强，因此，胆固醇酯必须转运到脂蛋白的疏水中心，即HDL核心是LCAT酶反应产物胆固醇酯的贮存库，随后通过胆固醇酯转移蛋白将胆固醇酯转移至其他脂蛋白和细胞膜上，并与其交换，完成胆固醇的转移（KimakE,etal.CellBiochemBiophys.2013;67(2):695-702.）。由于LCAT催化合成的胆固醇酯比胆固醇的疏水性更强，因此随着前β-HDL逐渐转变为成熟的、球状的α-HDL，而被转移至脂蛋白的疏水中心。在胆固醇酯转移蛋白和一些脂肪酶的协同作用下，α-HDL也可反转变为β-HDL。β-HDL的血浆半衰期很短，在肾中被迅速清除（CalabresiL,etal.Atherosclerosis.2012;222(2):299-306.），而α-HDL有一个较慢的转变的过程，表明LCAT在血浆HDL的代谢和决定血浆HDL水平中具有重要作用。此外，LCAT还主要参与胆固醇逆转运（reversecholesteroltransport,RCT）的血管内阶段，该过程也是HDL调节动脉粥样硬化形成和发展的主要机制。Calabresi等（CalabresiL,etal.JLipidRes.2011;52(8):1569-1574.）在研究LCAT血浆水平和颈动脉内膜厚度的相关关系时发现，在高心血管风险受试者中，男性受试者的血浆LCAT水平与颈动脉内膜厚度没有相关性，而在女性受试者中，LCAT血浆水平升高与颈动脉内膜厚度增加相关，表明LCAT与动脉粥样硬化的发生密切相关，并且存在性别差异。近年来的大量研究表明，HDL在一定程度上能很好地预测动脉粥样硬化及心血管疾病的发生风险，其中HDL介导的RCT功能尤为重要。Calabresi等（CalabresiL,etal.JInternMed.2015;277(5):552-561.）的研究发现，在慢性肾病患者中，伴随有获得性LCAT缺乏是其表现为低HDL水平的一个重要原因，因此LCAT成为了逆转血脂异常干预治疗的潜在目标，并有可能在这些慢性肾病患者中降低患心血管疾病的风险。Daniels等（DanielsJA,etal.CardiovascDiabetol.2014;13:16.）的研究发现，2型糖尿病患者增加水果和蔬菜摄取量后，LCAT和对氧磷酸酶1的水平和活性也随之升高，HDL3水平也有所上升，表明LCAT、HDL等均参与了抗动脉粥样硬化的发生、发展过程。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（AtchisonRW,etal.Science.1965;149:754-756.HogganMD,etal.ProcNatlSciUSA.1966;55:1467-1474.）。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA(RoseJA,etal.ProcNatlAcadSciUSA.1969;64:863-869.)，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(GeoffroyMC,etal.CurrGeneTher.2005;5(3):265-271.)，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(ChioriniJA,etal.CurrTopMicrobiolImmunol.1996;218:25-33.)，而不产生子代病毒。最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）(AtchisonRW,etal.Science.1965;149:754-756.)。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”（invertedterminalrepeat,ITR），呈回文-发卡结构(LusbyE,etal.JVirol.1980;34:402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(SamulskiRJ,etal.ProcNatlAcadSciUSA.1982;79:2077-2081.LaughlinCA,etal.Gene.1983;23:65-73.)。ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(XiaoX,etal.JVirol.1997;71(2):941-948.)。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Repbindingsite，RBS）和末端解链位点trs（terminalresolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(LindenRM,etal.ProcNatlAcadSciUSA.1996;93(15):7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(AshktorabH,etal.JVirol.1989;63(7):3034-3039.)。AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区(SrivastavaA,etal.JVirol.1983;45(2):555-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种优化的人卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶基因表达框，其特征在于，（Ⅰ）、包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；（Ⅱ）、表达框表达产物能够将HDL卵磷脂的C2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇酯。
【技术特征摘要】
1.一种优化的人卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶基因表达框，其特征在于，（Ⅰ）、包含SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；（Ⅱ）、表达框表达产物能够将HDL卵磷脂的C2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇酯。2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框。3.根据权利要求1所述基因表达框和权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，具有：（Ⅰ）、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或（Ⅱ）、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或（Ⅲ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列不同的序列；或（Ⅳ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）或（Ⅲ）所述序列至少有70%同源性的...
【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，董小岩，吴小兵，马思思，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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