一种酯酶WDEst17及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酯酶WDEst17及其编码基因和应用。本发明专利技术从囊孢菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis NRRL18085中克隆到了一个酯酶基因WDEst17，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为750bp，其编码的酯酶WDEst17的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共包含249个氨基酸。利用酯酶WDEst17制备得到了光学纯度大于99％的(R)‑3‑羟基丁酸乙酯。酯酶WDEst17具有较高的酶活和立体选择性等优点，在生物医药和精细化工领域具有非常大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种酯酶WDEst17及其编码基因和应用
：本专利技术属于生物化工和生物
，具体涉及一种酯酶WDEst17及其编码基因和应用。
技术介绍
：3-羟基丁酸乙酯的两种手性对映体是合成多种手性药物和化工产品的重要中间体。例如，(S)-3-羟基丁酸乙酯是昆虫信息素和手性香茅醇的重要手性中间体；而光学纯的(R)-3-羟基丁酸乙酯(R-EHB)是合成β-内酰胺酶抑制剂、β-内酰胺类抗生素和其他一些精细化工产品的重要中间体。因此，3-羟基丁酸乙酯等β-羟基酯的合成已经成为化工产业手性合成领域的研究热点。生物酶具有立体位点区域和底物的高度专一性，利用酶促反应催化具有反应条件温和、位点选择性强、副反应少、光学纯度高以及环境污染小等优点。酯酶(esterase)作为一种绿色的生物催化剂，不仅具有良好的有机溶剂和表面活性剂耐受性、较高的立体选择性，而且反应还不需要价格昂贵的辅酶和辅因子参与，已被广泛应用于手性药物和手性化工产品的合成。因此开发具有光学选择性的酯酶具有重要的意义。
技术实现思路
：本专利技术的针对现有技术中的不足，提供一种新的酯酶WDEst17及其编码基因和应用。本专利技术从一株囊孢菌Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.HamdenensisNRRL18085基因组中开发了一种新的酯酶WDEst17及其编码基因酯酶基因WDEst17，构建了含有酯酶基因WDEst17的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶WDEst17，其可应用于制备(R)-3-羟基丁酸乙酯。本专利技术的第一个目的是提供一种酯酶WDEst17，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶WDEst17的酯酶基因WDEst17。优选，所述的酯酶基因WDEst17的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供一种含有所述的酯酶基因WDEst17的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET28a(+)载体。本专利技术还提供一种含有所述的酯酶基因WDEst17的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术的第三个目的是提供所述的酯酶WDEst17在制备(R)-3-羟基丁酸乙酯中的应用。优选，所述的应用为酯酶WDEst17在拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯得到(R)-3-羟基丁酸乙酯中的应用。进一步优选，所述的应用为取酯酶WDEst17于pH为6.0～9.0的缓冲液中，再加入(±)-3-羟基丁酸乙酯，进行反应，得到(R)-3-羟基丁酸乙酯。所述的缓冲液，优选为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、Tris/HCl缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种。本专利技术的酯酶基因WDEst17来自一株囊孢菌Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.HamdenensisNRRL18085，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本专利技术用生物信息学分析的方法，从基因组测序的囊孢菌Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.HamdenensisNRRL18085中筛选得到酯酶基因WDEst17，全长为750bp(从起始密码子到终止密码子)，编码249个氨基酸。通过克隆编码成熟的酯酶WDEst17的酯酶基因WDEst17并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的酯酶WDEst17。酯酶WDEst17作为催化剂拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯，可得到光学纯度为99％的(R)-3-羟基丁酸乙酯。酯酶WDEst17作为绿色的生物催化剂，具有较高的酶活和立体选择性，在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。附图说明：图1是酯酶WDEst17的蛋白表达纯化情况。其中，M为蛋白Marker，1为未经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-WDEst17的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-WDEst17的大肠杆菌BL21(DE3)，3为镍柱穿透液，4为Ni柱纯化后得到的酯酶WDEst17，5为经过脱盐柱后的酯酶WDEst17。图2是酯酶WDEst17的底物特异性。图3是酯酶WDEst17水解反应的最适pH。图4是酯酶WDEst17水解反应的最适反应温度和温度稳定性。图5是不同浓度NaCl对酯酶WDEst17酶活性影响。图6是酯酶WDEst17拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯反应GC图；A为样品(±)-3-羟基丁酸乙酯气相图，B为酯酶WDEst17拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯反应3.5h后的气相图，其中S代表(S)-3-羟基丁酸乙酯，R代表(R)-3-羟基丁酸乙酯。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。本专利技术的酯酶基因WDEst17来自一株囊孢菌Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.HamdenensisNRRL18085，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。实施例1：酯酶基因WDEst17引物设计及开放阅读框边界确定提取囊孢菌Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.HamdenensisNRRL18085的基因组DNA，经测序验证无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基因WDEst17的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长为750bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶WDEst17的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，共249个氨基酸，该基因是一个全新的酯酶基因。根据分析得到的酯酶基因WDEst17序列，设计引物如下：正向引物：5′-CATGGATCCGTGAGCATCCCGCAGACA-3′，下划线部分为BamHI酶切位点；反向引物：5′-CACAAGCTTTCAGACGCCACGGAGTGCG-3′，下划线部分为HindIII酶切位点。实施例2：酯酶基因WDEst17的克隆及载体构建2.1PCR扩增将实施例1设计的引物(正向引物：5′-CATGGATCCGTGAGCATCCCGCAGACA-3′，反向引物：5′-CACAAGCTTTCAGACGCCACGGAGTGCG-3′)送至上海生物工程有限公司合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，囊孢菌Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.HamdenensisNRRL18085的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：表1PCR反应体系使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因WDEst17：a.94℃变性3min；b.94℃变性30s，55～65℃退火0.5～1min，72℃延伸1min，进行20个循环；c.72℃延伸10min，冷却到10℃。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察。回收768bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酯酶WDEst17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种酯酶WDEst17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种编码权利要求1所述的酯酶WDEst17的酯酶基因WDEst17。3.根据权利要求2所述的酯酶基因WDEst17，其特征在于，所述的酯酶基因WDEst17的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种含有权利要求2所述的酯酶基因WDEst17的重组表达载体。5.一种含有权利要求2所述的酯酶基因WDEst17的基因工程菌。6.权利要求1所述的酯酶WDEst17在制备(R)-3-羟基丁酸乙酯中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡云峰，王依龙，张云，孙爱君，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44