本发明专利技术公开了一种深海细菌来源低温耐盐酯酶E10及其编码基因与应用。本发明专利技术涉及酯酶基因e10来自深海细菌Croceicoccus marinus E4A9T，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所述的酯酶基因经异源表达后，底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活为29.4U/mg。酯酶E10酯酶催化水解最适温度为15～20℃；在1mol/L NaCl中仍能保持80％以上活性；在添加有机溶剂二甲基亚砜、甘油和异丙醇条件下，酶学活性增大。该酯酶具有低温和耐盐的特征，可应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、废水处理和洗涤工业等低温含盐条件下的工业生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种深海细菌来源低温耐盐酯酶、其编码基 因及其应用。
技术介绍
脂类水解酶是一类能够催化酯类化合物的水解和合成的酶。根据脂类水解酶的生 化特征和序列特征，微生物来源的脂类水解酶主要分为8大家族。大多数脂类水解酶的活 性位点Ser附近有一段相似的氨基酸序列Gly-x-Ser-x-Gly，但第II家族的活性位点附近 序列为Gly-Asp-Ser-Leu(⑶SL)，因此该家族又称为⑶SL家族。由于其结构的可变性，⑶SL 家族酯酶通常具有多种水解功能和较宽的底物谱，GDSL家族酯酶具有脂肪酶、蛋白酶、硫酯 酶、磷脂酶、芳香酯酶和酰基转移等多种活性，在工业中具有广泛的应用潜力。 近年来，随着分子生物学技术特别是测序技术的快速发展，微生物全基因组测序 已十分廉价和高效。基于全基因组测序数据并利用生物信息学分析手段，直接从基因组序 列中获得酶基因成为了获得新型酶的一种重要方法，称为"in silicon分析"。 低温酯酶由于在低温下具有较高或最好的活性，在食品风味改良和废水处理等工 业中比高温酯酶更具应用潜力，已受到广泛关注。海洋中大部分区域为低温环境，微生物在 海洋环境中演化出了适应低温的独特代谢方式，因此海洋微生物是低温酯酶的巨大宝库。 目前授权的低温细菌酯酶专利还较少。中国专利201110208211. 0提供了一种深海沉积物 来源的低温酯酶，其最适反应条件为20°C，最适催化底物为对硝基苯酚丁酸酯。此外，中 国专利201510015698. 7提供了一种最适反应条件为45°C的海洋来源适冷酯酶，该酯酶在 20°C以下具有较高催化活性和稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的深海细菌来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该 酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。 本专利技术针对分离自深海沉积物的细菌Croceicoccus marinus E4A9T(公众可以 从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买获得），基于全基因组序列分析筛选获得酯酶 基因 elO,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。酯酶基因 elO大小为618bp，碱基组成为： 106Α(17· 15%)、97Τ(15· 70% )、203C(32. 85% )和 212G(34. 30% )，编码蛋白大小为 205个 氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。将该酯酶序列在GenBank中进行同源搜 索，与之相似性最高的是同属细菌Croceicoccus naphthovorans中的酯酶，相似性为64% (其在GenBank数据库中的注册号为WP_047820200)。系统发育分析结果表明，酯酶ElO属 于酯酶家族中的第II家族。氨基酸序列分析结果显示，酯酶ElO活性位点丝氨酸附近序列 为具有甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和亮氨酸组成的保守区（氨基酸位置为27至30)，29位丝 氨酸与178位天冬氨酸和181位组氨酸共同构成酯酶催化中心，说明ElO属于酯酶第II家 族。综上所述，ElO应为酯酶家族中的一名新成员。 在不影响酯酶ElO蛋白活性前提下，可对SEQ ID N0:2所示的远离催化中心氨基 酸位置（优选远离27-30、178-181氨基酸位置）的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或 缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶ElO活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常 识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域 的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发 生在远离功能结构域（优选27-30、178和181氨基酸位置）的氨基酸位点，由于这一区域 不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影 响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶ElO突变体具有至少与SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以上的同源性，最优选具 有至少99%以上的同源性。 同理，本专利技术还提供了编码如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的基因序列，其与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列一致；本专利技术还提供对SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列中除 79-90、532-543位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从 而获得编码能基本保留酯酶ElO蛋白生物学活性的突变体基因。优选的酯酶ElO突变体基 因具有至少与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以 上的同源性，最优选具有至少99%以上的同源性。 利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶ElO基因连接到合适的载体上，并转化或 转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶E10。合适的原核生物宿主包括各种细 菌如E. coli等，合适的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳动物细胞（如中国仓 鼠卵巢细胞）等，优选采用原核表达系统E. coli。 合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载 体，原核表达载体如PET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α -A，pHIL-D2， pPIC9，pHIL-Sl (Invitrogen Corp. San Diego. California. USA);动物细胞表达载体 pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc. USA)等。一个优选的例子是将本专利技术筛 选到的酯酶基因 elO连接到大肠杆菌表达载体pSMT3上，并转化到大肠杆菌Rosetta (DE3) 中，经诱导表达出高活性的重组酯酶。 本专利技术还提供了酯酶ElO或能表达酯酶ElO的宿主菌在工业上的应用，例如可用 于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，酯酶ElO或上述能表达ElO酯酶的宿主菌可用 于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C8短碳链脂肪酸酯，同时对C10-C16的长碳链脂肪酸酯也具 有一定降解作用。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基 苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯和对硝基苯酚癸酸 酯等，其中底物为对硝基苯酚己酸酯（C6)时催化活性最高，酶活为29. 4U/mg。 ElO酯酶催化水解温度范围为15~35°C，优选为15~20°C ;所述水解的pH值为 4. 0~9. 0,优选为7. 0~7. 5。在lmol/L NaCl中仍能保持80%以上活性；在添加 EDTA、 Ba2+、Ca2+、C02+、Mg2+和S r2+条件下，对酶活影响不大；在添加有机溶剂二甲基亚砜、甘油和异 丙醇条件下，酶学活性增大。 本专利技术从深海沉积物来源细菌Croceicoccus marinus E4A9T中筛选获得新的低 温耐盐酯酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法 合成酯产品生产过程中。获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业 化生产低温耐盐酯酶，为后续的工业应用提供成本低廉的低温耐盐酯酶起始材料。该酶的 生产可在食品加工、洗涤剂和废水处理等低温或含盐生产工艺中显示本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酯酶，是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：(1)、其氨基酸序列与Seq ID NO.2所示序列一致；(2)、对SEQ ID NO.2所示的远离27‑30和178‑181位氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶活性的衍生蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许学伟，霍颖异，王春生，孟凡旭，王昭，崔恒林，
申请(专利权)人：国家海洋局第二海洋研究所，中国大洋矿产资源研究开发协会，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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