本发明专利技术公开了一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gE和gB基因的引物、探针、试剂盒及方法，所述方法为以待检测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制曲线。本发明专利技术的检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，能够检测出牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，可以对各种临床样品进行检测，从而可以快捷的对临床中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)感染情况进行监测，检测时间短，检测灵敏度高，稳定性高。
Detection of infectious bovine rhintracheitis virus by fluorescence quantitative PCR
The invention discloses a primer, probe, kit and method for detecting gE and gB genes of bovine infectious nasotracheitis virus (IBRV) by a fluorescent quantitative PCR. The method is to carry out fluorescence quantitative PCR amplification reaction, collect fluorescence signals and draw curves by using DNA as a template for testing samples. The primers and probes for the detection of infectious bovine rhinodermatitis virus (IBRV) have high specificity and sensitivity, and can detect the infectious bovine rhintracheitis virus (IBRV), and can detect all kinds of clinical samples, which can quickly monitor the infection of bovine infectious rhinootis virus (IBRV) virus in clinical. The detection time is short, the detection sensitivity is high, and the stability is high.
【技术实现步骤摘要】
一种牛传染性鼻气管炎病毒的荧光定量PCR检测方法
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及病毒性传染病的检测方法，特别是涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用领域。
技术介绍
牛传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBR)是牛的一种急性、热性、接触性传染病，其病原为牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV)，又名牛疱疹病毒I型(BHV-I)，该病在临床上表现多种病型，如上呼吸道粘膜炎症、脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜脑炎、乳房炎、流产等。该病早在20世纪50年代初在美国首次发现并于1956年首次被Madin从患牛中分离出来。1958年Kendrick从患有传染性脓疱性外阴-阴道炎的病牛中分离病毒，经研究证明，该病毒为IBRV。我国1980年首次从新西兰进口奶牛检测到病毒并分离出来。世界动物卫生组织(OIE)将IBR列为B类动物疫病，我国动植物检疫法中也明确规定，进出口牛必须检测IBR，以便控制本病的发生与流行。随后经血清学调查证明，我国大部分地区的牛群中均有IBRV感染，给我国养牛业造成了严重的影响。本研究以IBR的gE和gB基因为靶序列，建立了检测IBRV和区分gE基因缺失疫苗株和野毒株的实时荧光定量PCR方法。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。
技术实现思路
根据GenBank中登录的IBRVgE和gB基因序列，设计2对特异性引物及Taqman探针。建立了检测IBRVgE、gB基因实时荧光定量PCR方法，从而实现对IBRV的灵敏、高效、快速、准确检测。本专利技术的目的在于除通过双重实时荧光PCR方法可用于IBRV野毒感染与gE基因缺失疫苗免疫动物的鉴别，还能同时鉴别检测2个基因或进行gB、gE单基因鉴定。本专利技术的目的在于提供一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物，所述引物如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。本专利技术的目的在于提供一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物，所述引物如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。本专利技术的目的在于提供一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的探针，所述探针如SEQIDNO：5所示。本专利技术的目的在于提供一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的探针，所述探针如SEQIDNO：6所示。本专利技术的目的在于提供一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的探针，所述探针的5’端分别标记有ROX和FAM，探针的3’端分别标记有BHQ2和TAMRA。本专利技术的目的还在于提供将引物或探针用于制备检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒中。本专利技术的目的在于提供一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒，所述试剂盒包括检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物、以及检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的探针。本专利技术具体提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒检测方法，具体步骤如下：1.引物和探针的设计与合成：根据GenBank上发表的IBRVgE、gB基因序列(登录号：NC001847.1)，用DNAstar进行同源性分析，用Oligo6.24设计引物和探针，由上海生工合成。扩增长度分别为：112bp、78bp。探针的5’端分别以荧光基团ROX和FAM标记；3’端以荧光淬灭基团BHQ2和TAMRA标记。2.目标DNA模板的制备取毒液200μL，根据Takara病毒DNA/RNA提取试剂盒的说明书提取。25μL体系中加入12.5μLMix，9.5μLddH2O，模板，上下游引物各1μL。循环参数为：94℃预变性5min；94℃45s，59.7℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸8min；目的片段长度分别为112bp、78bp，PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD19-T载体，转化至DH5a大肠埃希菌，选取经双酶切鉴定和通过序列测定分析验证的阳性克隆质粒作为标准阳性。3.IBRV实时荧光定量PCR反应体系及参数：采用20μL反应体系，PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL，DNA模板2μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，上下游引物各0.6μL，其余用超纯水补齐至20μL。双重荧光定量PCR体系则按照1∶1的比例配制。反应参数为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火和延伸30s，共45个循环。本专利技术中，参照基因库中编号为NC001847.1的BHV-1gE、gB基因序列设计引物和荧光探针，该BHV-1基因序列长135305bp，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。本专利技术中，以BHV-1基因为模板，用引物gE扩增出长度为112bp的片段，该片段克隆至pMD-19T载体，得到目标模板。本专利技术中，以BHV-1基因为模板，用引物gB扩增出长度为78bp的片段，该片段克隆至pMD-19T载体，得到目标模板。同时，本专利技术充分考虑到，当gE和gB两模板同时扩增时，会竞争酶、引物和探针，对扩增产生影响，对共扩增体系的反应条件和检测低限进行了优化研究。双重荧光定量PCR体系则按照1∶1的比例配制。反应参数为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火和延伸30s，共45个循环。进一步本专利技术对牛传染性鼻气管炎病毒检测方法的特异性和可重复进行了确证，并建立了标准曲线。用本专利技术提供的扩增体系分别扩增了牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛、羊布鲁氏菌等核酸样品，被测样品均没有阳性扩增曲线，表明该方法具有较好的特异性。选取稀释度为1×107copies/μL的DNA模板，进行3次10倍倍比稀释，以1×104～1×106copies/μL三个稀释度为模板分别进行4次重复扩增，建立组内重复性试验。变异系数均小于2％，表明该方法具有良好的重复性。取1×100～1×109copies/μL10个稀释度作为DNA模板进行实时荧光定量PCR，每个稀释度做3次重复。观察TaqMan实时荧光定量PCR最低检出模板拷贝浓度，并与普通PCR比较分析。通过实施本专利技术具体的
技术实现思路
，可以达到以下有益效果。本方法检测时间短，传统的病毒分离法对IBRV的检测时间至少要在7d以上，该专利技术检测时间包括样品前处理到获得检测结果在2h之内，比常规的PCR检测方法至少也要缩短30min。检测灵敏度高，该方法可检测到2个拷贝的重组质粒，灵敏度比常规100-1000倍。特异性好，通过对IBRV、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛、羊布鲁氏菌等核酸样品检测，只有IBRV检测为阳性。重复性好，通过对不同浓度进行三次重复性检测，不同试验获得的Ct值，变异系数均在2％之内。稳定性高，通过对样品的重复性检测，均得到一致性结果。本方法可进行实时监测和定量检测，通过仪器对每个扩增反应中产生荧光信号的接收，实现对整个反应过程的实时监测和结果的定量检测。本方法流程简单，操作性强，易于掌握，只要具备分子生物学基础知识，无需良特别的训练便能很好完成。通过该方法的使用可实现对试验过程实施监测，有效的解决了传统检测方法中存本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物，其特征在于，所述引物如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。2.一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物，其特征在于，所述引物如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。3.一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的探针，其特征在于，所述探针如SEQIDNO：5所示。4.一种荧光定量PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的探针，其特征在于，所述探针如SEQIDNO：6所示。5.根据权利要求3-4所述的荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的探针，...
【专利技术属性】
技术研发人员：关平原，徐娜，李平安，申之义，张七斤，希尼尼根，周伟光，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15
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