西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，包括以下步骤：A、CGMMV、西瓜嗜酸菌和西瓜EF‑1α基因特异性引物的确定；B、西瓜样品核酸的快速提取；C、反转录；D、优化选择多重RT‑PCR反应条件；E、多重PCR灵敏度检测；“一步法”同时检测CGMMV和西瓜嗜酸菌的多重PCR。通过对核酸提取、PCR反应条件及反应体系优化，将两种病原物单独检测的分子技术，改良为一套快速高效的检测方法。这套方案通过“一步法”的一次性PCR同时检测CGMMV和西瓜嗜酸菌，达到缩短鉴定时间、节约生化试剂，降低成本，减少环境污染，为两种检疫性病害的监测、预测预报和防治提供理论基础和技术保障。

Multiple PCR method for diagnosis and pathogen detection of watermelon disease and fruit blotch

The invention discloses a multiple PCR method for the diagnosis of watermelon blood pulp disease and fruit spot disease and detection of pathogen, including the following steps: Determination of A, CGMMV, watermelon eosinophilic bacteria and watermelon EF 1 alpha gene specific primers; B, rapid extraction of nucleic acid of watermelon samples; C, reverse transcription; D, optimum selection of multiple RT PCR reaction conditions; E, E, Multiplex PCR sensitivity test was used to simultaneously detect multiple PCR of CGMMV and watermelon acidophilic bacteria. Through the extraction of nucleic acid, the conditions of PCR reaction and the optimization of the reaction system, the molecular technology of two kinds of disease originals was improved to a fast and efficient method. This scheme uses one step PCR to detect CGMMV and watermelon eosinophilic bacteria at the same time, so as to shorten the identification time, save the biochemical reagents, reduce the cost, reduce the environmental pollution, and provide the theoretical basis and technical support for the monitoring, prediction and prevention of two quarantine diseases.

【技术实现步骤摘要】
西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法
本专利技术植物病毒检测领域，尤其涉及一种西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法。
技术介绍
西瓜是我国重要的果蔬产业，近年来随着栽培面积增加、新品种和种苗的引进，致使黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)引起的西瓜血瓤病和西瓜噬酸菌(Acidovoraxcitrulli)引起的西瓜细菌性果斑病两种重大检疫性病害在我国西瓜产区严重发生，给我国西瓜生产造成了巨大经济损失。两种病害都可以通过种苗和嫁接传播，传播速度快，距离远，建立两种病害快速准确的检测方法对于防止两种病害的发生和传播具有重要的意义。黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)是正单链RNA病毒，属于帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员，是世界范围内葫芦科作物上一种重要检疫性病毒，可侵染西瓜、甜瓜、黄瓜等多种葫芦科作物，严重威胁葫芦科作物的品质和产量，造成重大经济损失。近年来随着进口瓜类种子传入我国，CGMMV的发生使得多地区葫芦科作物损失惨重。CGMMV侵染西瓜，使其种子周围果肉凹陷、变为紫红色或暗红色，果质呈水渍状、纤维化，严重时果肉会变为暗褐色并出现空洞，果实出现酸化及腐败现象，俗称“血瓤病”。CGMMV对西瓜产量的影响尤为显著，寄主一旦染病，难以根除，一般造成减产20％以上，严重的甚至绝收。西瓜细菌性果斑病是一种典型的种传细菌性病害，病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovoraxcitrulli)，已被列入我国禁止进境的检疫性有害生物病原菌。除侵染西瓜外，西瓜噬酸菌还能危害甜瓜、南瓜、黄瓜、西葫芦等其他葫芦科作物。西瓜噬酸菌侵染西瓜后，叶片初期出现水渍状病斑，后渐变成不规则的褐色病斑，有菌脓溢出，干后形成白色发亮的菌痂。果皮初期出现水渍状凹陷斑点，渐变为褐色大斑，后期果皮龟裂，表面溢出粘稠、透明的琥珀色菌脓，严重时果实很快腐烂。病菌一旦传入，在高温高湿环境下快速繁殖，苗期发病造成烂苗毁苗，果实膨大期发病减产20％以上。目前该病害已在国内多个省份发生，给当地的西瓜、甜瓜等种植业造成巨大损失。CGMMV的检测主要有生物学检测、血清学检测、分子生物学检测及电镜显微观察等方法；西瓜嗜酸菌主要使用的检测方法有血清学检测和基于PCR的检测等。生物学鉴定存在稳定性较差与工作量大等缺点。血清学检测方法是一种用于常规检测的有效方法，但是该方法需要特异性的抗体，制作抗体过程繁琐、费时较长。利用电子显微镜技术可观察受侵染细胞的结构变化以及病毒粒体的形态和大小，通常只能起辅助鉴定的作用。分子生物学PCR方法可以灵敏、特异、快速检测植物病原病毒和细菌，为两种检疫性病害的检测和流行提供基础和技术保障。到目前为止，检测CGMMV需要提取样品RNA后先进行反转录再进行PCR检测，而西瓜嗜酸菌可以提取样品DNA后直接进行PCR检测。为了检测CGMMV和西瓜嗜酸菌需要分别进行RNA和DNA的提取，然后进行两次PCR反应，这种对不同病原物进行检测的方法存在方案效率低，周期较长，生化试剂消耗偏多等缺陷。本专利提供一套快速高效并能同时检测黄瓜绿斑驳花叶病毒和西瓜噬酸菌的方案，达到“一步法”快速检测，通过对核酸提取、PCR反应条件及反应体系优化，将两种病原物单独检测的分子技术，改良为一套快速高效的检测方法。这套方案可以通过“一步法”的一次性PCR同时检测CGMMV和西瓜嗜酸菌，达到缩短鉴定时间、节约生化试剂，降低成本，减少环境污染，为两种检疫性病害的监测、预测预报和防治提供理论基础和技术保障。经文献检索，未见与本专利技术相同的公开报道。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中的缺陷，结合现代分子生物学研究技术手段，建立了一套高效、经济并能同时检测CGMMV和西瓜噬酸菌的技术体系，专利技术了“一步法”快速检测方法，即在一个PCR反应中以西瓜EF-1α基因为内参，加入两对检测不同病原物的引物，实现快速、准确地检测CGMMV和西瓜嗜酸菌的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，为两种检疫性病害的监测、预测预报和防治提供理论基础和技术保障。本专利技术的技术方案如下：一种西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，包括以下步骤：A、CGMMV、西瓜嗜酸菌和西瓜EF-1α基因特异性引物的确定；B、西瓜样品核酸的快速提取；C、反转录；D、优化选择多重RT-PCR反应条件；E、多重PCR灵敏度检测。优选的，所述的步骤D中，所述的优化的多重RT-PCR反应条件，包括：引物终浓度、退火温度、延伸时间和循环数。优选的，所述的步骤D中，所述的优化的引物终浓度为：CGMMV、Ac-ITS、EF-1α引物终浓度分别为0.1、0.1、0.2μM。优选的，所述的步骤D中，所述的优化的退火温度为：48.2～55.9℃。优选的，所述的步骤D中，所述的优化的延伸时间为：45～60s。优选的，所述的步骤D中，所述的优化的循环数为：35～40。本专利技术的有益之处在于：本专利技术公开了一种西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，“一步法”同时检测CGMMV和西瓜嗜酸菌的多重PCR。通过对核酸提取、PCR反应条件及反应体系优化，将两种病原物单独检测的分子技术，改良为一套快速高效的检测方法。这套方案可以通过“一步法”的一次性PCR同时检测CGMMV和西瓜嗜酸菌，达到缩短鉴定时间、节约生化试剂，降低成本，减少环境污染，为两种检疫性病害的监测、预测预报和防治提供理论基础和技术保障。附图说明图1：西瓜叶片核酸电泳图；其中，M：2,000bpDNAMarker；泳道1～8：4μl西瓜叶片核酸提取物。图2：多重RT-PCR引物浓度优化图；其中，M：2,000bpDNAMarker；泳道1～7对应表2中1～7试验号中的引物浓度组合。图3：多重RT-PCR退火温度的优化图；其中，M：2,000bpDNAMarker；1～10：退火温度分别为48.2、48.9、50.1、51.6、53.6、55.9、58.0、59.6、60.9、61.6℃。图4：多重RT-PCR延伸时间的优化图；其中，M：2,000bpDNAMarker；1～6：延伸时间分别为15，25，35，45，60和80s。图5：多重RT-PCR循环数的优化图；其中，M：2,000bpDNAMarker；1～6：分别为15，20，25，30，35和45循环。图6：多重RT-PCR灵敏度检测图；其中，M：2,000bpDNAMarker；1～7：PCR模板分别为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的反转录产物；8：以ddH2O为模板的阴性对照。图7：多重RT-PCR反应特异性检测图；其中，M：2,000bpDNAMarker；1～12分别为：ddH2O、健康西瓜、CGMMV和西瓜嗜酸菌、CGMMV、黄瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、西瓜嗜酸菌和西瓜细菌性角斑病菌。图8：多重RT-PCR和单重RT-PCR的方法对辽宁地区西瓜叶片与种子检测结果比较图；其中，A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：A、CGMMV、西瓜嗜酸菌和西瓜EF‑1α基因特异性引物的确定；B、西瓜样品核酸的快速提取；C、反转录；D、优化选择多重RT‑PCR反应条件；E、多重PCR灵敏度检测。

【技术特征摘要】
1.一种西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：A、CGMMV、西瓜嗜酸菌和西瓜EF-1α基因特异性引物的确定；B、西瓜样品核酸的快速提取；C、反转录；D、优化选择多重RT-PCR反应条件；E、多重PCR灵敏度检测。2.如权利要求1所述的西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，其特征在于，所述的CGMMV基因特异性引物对为CGMMV-F/CGMMV-R；其中CGMMV-F的基因序列为TGGTGCTACTGTTGCTCTGG，CGMMV-R的基因序列为GAAGCGAAACGAAGATAGGC。3.如权利要求1所述的西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，其特征在于，所述的西瓜嗜酸菌基因特异性引物对为Ac-ITS-F/Ac-ITS-R；其中，Ac-ITS-F的基因序列为TCCTCCACCAACCAATACGCT，Ac-ITS-R的基因序列为CGTCATTACTGAATTTCAACA。4.如权利要求1所述的西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重PCR方法，其特征在于，所述的西瓜EF-1α基因特异性引物对为SlEF-1α...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏子豪，吴元华，毕馨月，于海博，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21