一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两对特异性引物：外引物：上游IVF145：GGAGCATTGAAGTTGGATAC；下游IVR961：GAAGGATGGATACAACAACA；内引物：上游IVF300：AGTAATCGGCAGTCATCAC；下游IVR646：GGTGAATGGTGGTCTTATCC。本发明专利技术基于常规PCR的操作方法和仪器设备，但比常规PCR方法具有更高的检测灵敏性和特异性，大幅增加了对虾虹彩病毒隐性感染时的病原检出率，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。本发明专利技术对检测的仪器设备和操作技能要求较低，利于在基层单位和养殖企业应用与推广。

A PCR detection kit for shrimp iridescent virus set

The invention relates to a shrimp iridescent virus set PCR detection kit, which includes two pairs of specific primers: external primers: upstream IVF145:GGAGCATTGAAGTTGGATAC; downstream IVR961:GAAGGATGGATACAACAACA; internal primers: upstream IVF300:AGTAATCGGCAGTCATCAC; downstream IVR646: GGTGAATGGTGGTCTTATCC. The invention is based on the conventional PCR operation method and equipment, but has higher detection sensitivity and specificity than the conventional PCR method, and greatly increases the pathogenic detection rate of the recessive infection of the shrimp iridvirus, and is suitable for the early monitoring of the recessive infection of the shrimp iridvirus. The invention has low requirements for testing instruments and operation skills, and is suitable for application and promotion in grass-roots units and aquaculture enterprises.

【技术实现步骤摘要】
一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒
本专利技术属于对虾虹彩病毒疾病检测领域，特别涉及一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒。
技术介绍
虹彩病毒宿主多、分布范围广，是已知水生动物病毒中危害较为普遍的一种病毒,在世界范围内引起的水生动物高发病率和高死亡率现象给水产业造成了重大经济损失。虹彩病毒科共分5个属，其中，虹彩病毒属和绿虹彩病毒属主要感染无脊椎动物。近两年调查研究发现，我国养殖对虾普遍存在虹彩病毒感染。养殖日本囊对虾和凡纳滨对虾的虹彩病毒感染率均在10％以上，流行地区野生日本囊对虾的虹彩病毒感染率更是高达50％以上，预示着很高的养殖和放流风险。常规的病毒检测技术如组织病理、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次确诊等缺点，而聚合酶链式反应(PCR)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量极小的特点，特别适用于育苗亲虾的筛选(损伤小)和放流虾苗的病原监测。而在常规PCR基础上发展起来的套式PCR技术，则具有更高的灵敏性，可大幅提高病原检出率。只需要一台普通PCR仪，即可获得近似实时荧光定量PCR的检测灵敏性。因此，建立对虾虹彩病毒套式PCR检测技术，不仅可监测到对虾虹彩病毒的微量潜伏感染，实现对对虾虹彩病毒病的早期预警，而且对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，检测成本也较低，利于在基层单位和养殖生产一线应用与推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，该试剂盒比常规PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，大幅提高了病毒微量感染时对虾虹彩病毒的检出率，而对设备和人员技术要求较低，因此，适用于对虾虹彩病毒微量隐性感染时期的监测和虹彩病毒病的早期预警，利于在基层单位与养殖企业应用和推广。本专利技术提供了一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两对特异性引物：外引物：上游IVF145：5'-GGAGCATTGAAGTTGGATAC-3'，下游IVR961：5'-GAAGGATGGATACAACAACA-3'；内引物：上游IVF300：5'-AGTAATCGGCAGTCATCAC-3'，下游IVR646：5'-GGTGAATGGTGGTCTTATCC-3'。所述试剂盒第一轮反应总体积50μl体系，其中，HotstartDNApolymerase(5U/μl)0.25μl，10×HotstartDNApolymerasebuffer(Mg2+20mM)5μl，dNTPs(各2.5mM)4μl，IVF145(10μM)1μl，IVR961(10μM)1μl，DNA模板2μl，ddH2O36.75μl；第二轮反应总体积50μl体系，其中，HotstartDNApolymerase(5U/μl)0.25μl，10×HotstartDNApolymerasebuffer(Mg2+20mM)5μl，dNTPs(各2.5mM)4μl，IVF300(10μM)5μl，IVR646(10μM)5μl，第一轮PCR扩增产物2μl，ddH2O28.75μl。所述试剂盒第一轮的反应条件为：95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃55s循环30次；最后72℃5min；第二轮的反应条件为：95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃30s循环30次；最后72℃5min。本专利技术是基于普通PCR仪的套式PCR检测技术，具有成本低、易操作的特点。特异性试验显示，本专利技术对宿主对虾及其养殖过程中的常见病原——气单胞菌、副溶血弧菌和对虾白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫等的DNA模板都没有扩增，而对对虾虹彩病毒阳性DNA模板扩增良好，显示本试剂盒具有很强的病原特异性；灵敏性试验表明，当反应体系中的对虾阳性样品DNA的模板量为100拷贝/μl时，通过该套式PCR试剂盒扩增仍能获得可见电泳条带。而且，在实际应用中，本专利技术比常规PCR方法也具有更高的病毒检出率，显示了更高的模板扩增效率，因此，本专利技术建立的对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒具有较高的病原特异性和灵敏性，适用于对虾虹彩病毒微量隐性感染时期的监测，可作为对虾虹彩病毒防控过程的技术支撑。有益效果本专利技术的试剂盒比常规PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，大幅提高了病毒微量感染时对虾虹彩病毒的检出率，而对设备和人员技能要求较低，因此，适用于对虾虹彩病毒微量隐性感染时期的监测和虹彩病毒病的早期预警，利于在基层单位与养殖企业应用和推广。附图说明图1为实施例1对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒的灵敏性试验。M：DL2000marker；1～5为常规PCR方法(一对外引物)扩增结果；6～10为本专利技术套式PCR试剂盒扩增结果。其中，1和6：1000copies(拷贝)；2和7：100copies；3和8：50copies；4和9：10copies；5和10：无DNA酶水。图2为实施例1对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒的特异性试验。M：DL2000marker；1、虹彩病毒阳性样品；2、对虾白斑综合征病毒；3、气单胞菌；4、副溶血弧菌；5、虾肝肠胞虫；6、无DNA酶水。图3为实施例2对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒对部分凡纳滨对虾样品的检测结果。M:DL2000marker；1～9代表不同凡纳滨对虾样品；10：无DNA酶水。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.引物设计与合成根据对虾虹彩病毒MCP基因序列分别设计了5对外引物和5对内引物，并经生工生物工程股份有限公司合成备用。2.DNA提取取对虾鳃丝和头胸部组织约40-50mg，用水生动物组织DNA提取试剂盒提取总DNA作为扩增模板。3.对虾虹彩病毒套式PCR试剂盒3.1最佳引物和反应程序根据扩增的产物量及其特异性等条件，本专利技术经过系列实验筛选出最佳套式PCR引物，即：外引物：上游IVF145：5'-GGAGCATTGAAGTTGGATAC-3'；下游IVR961：5'-GAAGGATGGATACAACAACA-3'；内引物：上游IVF300：5'-AGTAATCGGCAGTCATCAC-3'；下游IVR646：5'-GGTGAATGGTGGTCTTATCC-3'。其第一轮反应条件为：95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃55s循环30次；最后72℃5min；第二轮反应条件为：95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃30s循环30次；最后72℃5min。并经过系列实验，确定试剂盒最佳试剂组成为：第一轮反应总体积50μl体系，其中，HotstartDNApolymerase(5U/μl)0.25μl，10×HotstartDNApolymerasebuffer(Mg2+20mM)5μl，dNTPs(各2.5mM)4μl，IVF145(10μM)1μl，IVR961(10μM)1μl，DNA模板2μl，ddH2O36.75μl；第二轮反应总体积50μl体系，其中，HotstartDNApolymerase(5U/μl)0.25μl，10×HotstartD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括两对特异性引物：外引物：上游IVF145：5'‑GGAGCATTGAAGTTGGATAC‑3'，下游IVR961：5'‑GAAGGATGGATACAACAACA‑3'；内引物：上游IVF300：5'‑AGTAATCGGCAGTCATCAC‑3'，下游IVR646：5'‑GGTGAATGGTGGTCTTATCC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括两对特异性引物：外引物：上游IVF145：5'-GGAGCATTGAAGTTGGATAC-3'，下游IVR961：5'-GAAGGATGGATACAACAACA-3'；内引物：上游IVF300：5'-AGTAATCGGCAGTCATCAC-3'，下游IVR646：5'-GGTGAATGGTGGTCTTATCC-3'。2.根据权利要求1所述的一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒第一轮反应总体积50μl体系，其中，HotstartDNApolymerase0.25μl，10×HotstartDNApolymerasebuffer5μl，dNTPs4μl，IVF1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊芳，程家骅，房文红，李楠英，李新苍，王元，姜亚洲，赵姝，马清扬，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31