质谱法检测甲型流感病毒H7N9多重PCR产物的方法及其产品技术

本发明专利技术提供一种通过质谱法直接检测甲型流感病毒的多重PCR产物的方法，包括使用特定引物对病毒DNA进行多重PCR扩增，并通过MALDI‐TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小。该方法可检测选自H7N9亚型甲型流感病毒。本发明专利技术还保护相关检测产品。本发明专利技术方法将多重PCR和MALDI‐TOF MS相结合用于临床病原微生物鉴定，不仅快速、简便，还易观察、直观、准确性高。

Detection of multiple PCR products of influenza A virus H7N9 by mass spectrometry and its products

The present invention provides a method for direct detection of multiple PCR products of influenza A virus by mass spectrometry, including multiplex PCR amplification of virus DNA using specific primers and detection of fragments of multiple PCR products by MALDI - TOF MS. This method can detect influenza A virus from H7N9 subtype. The invention also protects the related detection products. The method combines multiple PCR and MALDI - TOF MS for identification of clinical pathogenic microbes. It is not only fast, simple, but also easy to be observed, intuitionistic and accurate.

【技术实现步骤摘要】
质谱法检测甲型流感病毒H7N9多重PCR产物的方法及其产品
本专利技术属于分子生物学检测的
，涉及一种利用质谱特征峰图检测多重PCR产物的方法及其产品。本专利技术还涉及使用多重PCR扩增技术检测甲型流感的引物组和试剂盒。
技术介绍
流行性感冒简称“流感”，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有突然爆发、迅速蔓延、波及面广的特点，主要通过咳嗽和打喷嚏传播。流感在人类历史上已存在很长时间，早在1580年就有了全球性流感记录。20世纪共爆发过四次：1918-1920年的西班牙流感(H1N1)，1957年的亚洲流感(H2N2)，1968年的我国香港地区流感(H3N2)和1977年的俄罗斯流感(H1N1再次爆发)。我国在近半个世纪以来(1953年至今)，共发生大中小规模的流感17次，其中2次为大流行。引起流感的病毒是单链核糖核酸病毒，有球形及多形性，直径约80-100nm。也有细丝状的，直径可能就几微米大小。根据其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原性的不同被分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒具有很强的变异性，是引起人类、家畜及禽类流感流行的主要病毒。甲型流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，为有包膜分节段的单负链RNA病毒。其基因组由8个单股负链RNA片段组成，每个基因在3′末端和5′末端都带有12-13个保守核苷酸序列。这8个片段可编码10种蛋白，其中，8个蛋白(HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA)为结构蛋白，NS1和NS2为非结构蛋白，位于宿主细胞的胞质中。根据HA和NA抗原性的差异，甲型流感病毒可分为若干亚型，迄今已发现有18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。任何一对HA和NA均可组合成一个亚型，如H1N1、H3N2、H5N1和H7N9等。甲型流感病毒能产生低保真RNA聚合酶。低保真RNA聚合酶可引起流感病毒的高突变率以及基因重组，可使流感病毒呈现分子多样性，使每个病毒亚型可进化为多个分支。甲型H1N1流感病毒由经典猪流感病毒、人H3N2型流感病毒、北美禽流感病毒在20世纪90年代后期经过“三重配”后再与北美猪群中流行的H3N2和H1N2猪流感病毒及Eurasiaavian-like猪流感病毒重配后而产生，HA和NA抗原的持续变异是引起病毒流行的主要原因。同样地，在家禽市场中，H5N2也会出现持续的重组变异。2012年在西藏的鸡群中就分离到一株天然的H9N2和H5N1重组的H5N2亚型流感病毒。近期报道表明，对水禽长期使用某种药物会导致H5N2亚型流感病毒发生突变进而更易于感染人类。而2013年3月底在上海发现的新型禽流感H7N9病毒是由5个病毒经过4次重组产生，产生两个主要流行株A和B型。即由野鸟H7N9(NA节段)、浙江的H7N3病毒(HA节段)及北京、江苏、上海浙江的家禽H9N2病毒(除HA和NA节段外)重组而产生。由于RNA聚合酶缺乏校正和修复功能，每个核苷酸在复制周期中突变率极高。另外，流感病毒宿主种类繁多，而且分段基因组复制周期短，感染频率高，因此在复制过程中极易发生变异，产生新毒株或新的亚型变种，这种情况在甲型性流感病毒中表现最为突出。并且，这种快速而持续的变异，使得机体免疫系统不能对流感病毒产生长期的免疫力，从而导致流感的反复流行和难以控制。流感的确诊需要实验室检查证实，目前较为常见的检测方法有病毒分离培养、病毒核酸检测、血清学检测、病毒抗原检测、基因芯片技术等。快速检测方法包括酶联免疫法(ELISA)、流感抗原快速检测试剂盒等、直接和间接免疫荧光法、基于PCR的方法、测序法、寡核苷酸微阵列芯片法和核酸扩增产物质谱检测法等。目前国内外有一些针对人甲型流感筛查的商品化试剂盒，灵敏度、特异度较高，常见的主要为抗原检测试剂盒(胶体金法)和荧光定量PCR(双重或多重)这2种商品。目前市场上已出现大量利用多重荧光PCR和胶体金的试剂盒可检测一种流感病毒，对甲乙型流感进行分型。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，即Matrix-AssistedLaserDesorptionIonisation-Time-Of-FlightMassSpectrometry(MALDI-TOFMS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比。MALDI-TOF这种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定，不产生或产生较少的碎片离子。Chou等([J].JNanotechnology，2011，9:52)报道了联合使用抗体-磁珠和MALDI-TOFMS以提高对流感病毒检测的敏感性和特异性，该方法使用抗病毒单克隆抗体包被的磁珠作为特异性探针吸附病毒，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳提取蛋白质，然后采用MALDI-TOFMS测定其蛋白质构成，得出鉴定结论。此方法可在1h内完成流感病毒的诊断，适用于快速筛查和早期确诊，对流感病毒的预防，疫苗接种和早期治疗具有重要意义。然而，该方法涉及免疫处理，过程复杂，因此限制其大规模应用。此外，使用MALDI质谱检测大分子核酸时，由于样品离子化程度弱，获得样品信号峰困难，因此，有关MALDI质谱检测大分子核酸的研究报道并不多。1994年，唐凯等报道了大分子核酸质谱检测的相关工作，他们使用MALDI质谱，成功检测到了片段大小为500bp的大分子核酸，该研究拓宽了MALDI质谱检测核酸样品的质量范围。中国专利申请201210272533.6“建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品”，公开了一种基于质谱技术快速鉴定幽门螺杆菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。该方法利用飞行时间质谱技术，对分子量和丰度各异的核酸片段进行检测，并形成谱图。但是，该方法中核酸片段经PCR的单碱基延伸扩增后，还需经过SAP酶消化、转录和核酸酶切，仅能识别单个碱基的变化，无法检测有特征序列的长片段DNA。此外，基于MALDI-TOFMS，开发了一些核酸检测方法，如美国Agena公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOODassay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。各公司为了提高质谱仪的分辨率，对目标位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含单核苷酸多态性(SNP)位点的多重PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOODassay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。然而，以上方法，都不可避免地存在操作复杂，耗时长等问题。此外，美国Sampath等([J].PLoSOne，2007，2(5):e489)报道了将RT-PCR和电喷雾色谱相结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质谱法检测流感病毒多重PCR产物的方法，包括如下步骤：使用经设计的引物组合对流感病毒DNA进行多重PCR扩增；将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过MALDI‐TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小；其中，所述引物组合为扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片断、N9片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H7片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、用于扩增甲型流感病毒N9片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

【技术特征摘要】
1.一种质谱法检测流感病毒多重PCR产物的方法，包括如下步骤：使用经设计的引物组合对流感病毒DNA进行多重PCR扩增；将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过MALDI‐TOFMS检测多重PCR产物的片段的大小；其中，所述引物组合为扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片断、N9片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H7片断的特异性引物序列为SEQIDNO.15和SEQIDNO.16、用于扩增甲型流感病毒N9片断的特异性引物序列为SEQIDNO.17和SEQIDNO.18，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。2.权利要求1的方法，其中所述引物组合可根据需要加入tag序列ACGTTGGATG，使多重PCR产物的大小能够容易地由质谱法进行区分。3.权利要求1‐3任一所述的方法，其中在所述PCR扩增的反应体系25μl中含有：每组引物0.5‐1μl，浓度控制在10‐20μM之间dNTP与Taq酶预混物12.5μlDNA模板1‐3μl余量为双蒸水。4.权利要求3的方法，其中在PCR扩增反应程序为：94‐95℃预变性5min；94‐95℃变性30s，55‐60℃退火30s，72‐75℃延伸40‐60s，进行35...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，钟逾，安娜，高佳敏，刘昕超，王佳，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11