小鼠抗人Desmin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株制造技术

一种小鼠抗人Desmin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌Desmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为TSG11，保藏编号为：CGMCC No. 12693。本发明专利技术还提供了所述杂交瘤细胞株TSG11产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测Desmin表达。

Mouse anti human Desmin monoclonal antibody and hybridoma cell line secreting this monoclonal antibody

A mouse anti human Desmin monoclonal antibody and hybridoma cell line secreting this monoclonal antibody. The clone number of hybridoma cell line secreting Desmin monoclonal antibody is TSG11, and its preservation number is: CGMCC No. No. 12693. The invention also provides a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line TSG11. The antibody includes heavy chain variable region and light chain variable region. The amino acid sequence of heavy chain variable region is SEQ ID NO:9, and the light chain variable region amino acid sequence is SEQ ID ID NO:10. The antibody can be used to detect Desmin expression in scientific research or clinical immunohistochemistry.

【技术实现步骤摘要】
小鼠抗人Desmin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株
本专利技术涉及以原核表达的Desmin蛋白免疫小鼠获得的分泌Desmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株TSG11，属于生物工程

技术介绍
Desmin（结蛋白）最初发现于1977年，是一种分子量50-55kD的中间丝蛋白，定位于胞浆；在平滑肌、骨骼肌和心肌细胞中表达，胚胎和成人横纹肌或平滑肌及其肿瘤均可表达，为肌源性分化的一个很好的标记物。子宫、皮肤、胃肠道及其他部位的平滑肌多呈阳性表达。Desmin是一种重要的细胞骨架蛋白，在维持细胞内结构和胞外基质联结中起重要作用。近年来，细胞骨架蛋白在恶性肿瘤的发生和侵袭中起到的作用逐渐受到重视，骨架蛋白在各种恶性肿瘤中的研究与逐渐成为热点。Desmin对肌细胞的特异性使之成为有效识别源于平滑肌和横纹肌细胞的肉瘤，如平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。Desmin主要用于子宫、皮肤和胃肠道平滑肌肿瘤、横纹肌肿瘤和肌上皮肿瘤的诊断和鉴别诊断。目前，国内外已经获得了多种抗Desmin的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的抗Desmin的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测Desmin表达的小鼠抗人Desmin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：（1）根据Desmin的基因序列（NM_001927）的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增Desmin基因，构建重组表达载体PET28a-Desmin，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。（2）采用经典的细胞融合技术制备Desmin单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。（3）通过免疫组织化学分析Desmin单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。（4）根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体Desmin重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体Desmin的重链和轻链可变区序列。本专利技术提供的以原核表达的Desmin蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌Desmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为TSG11，分类命名为小鼠抗人Desmin杂交瘤细胞系，该细胞株已于2016年08月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNo.12693。本专利技术还提供了所述杂交瘤细胞株TSG11，CGMCCNo.12693产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:10。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术应用重组人的Desmin蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠,采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗Desmin的杂交瘤细胞株，命名为TSG11，亚型鉴定为IgG1，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用ProteinA亲和层析法对Desmin单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上。人乳腺癌石蜡切片经抗Desmin抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到呈均匀着色的棕黄色颗粒，定位于胞浆，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本专利技术制备了高效价，高特异性的Desmin单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的Desmin蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测Desmin表达。附图说明图1SDS-PAGE分析纯化后的Desmin单克隆抗体；图2ELISA法测定Desmin单克隆抗体滴度；图3免疫组织化学检测分析Desmin单克隆抗体染色人子宫石蜡切片；图4免疫组织化学检测分析Desmin单克隆抗体染色人骨骼肌石蜡切片。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例1：杂交瘤细胞株TSG11及其产生的单克隆抗体的获得1、抗原制备（1）获得目的基因在该实施例中，根据Desmin的基因序列（NM_001927）的编码框，设计1对特异引物：引物1：5'-ATAGGATCCATGAGCCAGGCCTACTCGTC-3'(SEQIDNO:1)引物2：5'-CTCGAGTTAGAGCACTTCATGCTGCTGC-3'(SEQIDNO:2)TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增Desmin基因。（2）构建重组表达载体将步骤（1）获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-Desmin。（3）获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤（2）获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（4）诱导表达和蛋白纯化将步骤（2）提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mMIPTG诱导表达，16℃诱导过夜，收集菌液超声，取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化Desmin蛋白。2、单抗的制备和纯化(1)、免疫动物一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫。纯化的重组蛋白Desmin（用适量生理盐水稀释）+完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白Desmin（用适量生理盐水稀释）+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白Desmin（用适量生理盐水稀释），不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫后7~10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。加强免疫（融合前3天），用纯化的Desmin蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。(2)、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合（1:5~1:10），并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以纯化的Desmin蛋白（10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以原核表达的Desmin蛋白免疫小鼠获得的分泌Desmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株TSG11，保藏编号为CGMCC No. 12693。

【技术特征摘要】
1.一种以原核表达的Desmin蛋白免疫小鼠获得的分泌Desmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株TSG11，保藏编号为CGMCCNo.12693。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：何小丹，刘晨，
申请(专利权)人：天津三箭生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12