一种目的蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质纯化，具体公开了一种目的蛋白的纯化方法，即一种从包含目的蛋白和至少一种污染物的混合物中纯化目的蛋白的方法。在对所述混合物进行匀浆破碎后，无需使用切向流过滤和滤器死端过滤，仅先后进行阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤，即可实现目的蛋白的分离纯化。所获得的目的蛋白纯度可达95％以上，且内毒素小于30EU/mg。本发明专利技术不仅对于某些不适于超滤和过滤的蛋白有重要价值，对于其他蛋白质也节约了处理时间，提高了目的蛋白的回收率。按照本发明专利技术所述方法纯化得到的目的蛋白或含有目的蛋白和药学可接受载体的组合物，可用于对此类目的蛋白和组合物已知的各种诊断、治疗或其他用途，例如人类疫苗制品的制备等。

A purification method of target protein

The present invention relates to protein purification, in particular a purification method of a target protein, a method for purifying the target protein from a mixture containing the target protein and at least one pollutant. After homogenizing the mixture, there is no need to use tangential flow filtration and filter dead end filtration. The separation and purification of the target protein can be achieved only by anion exchange chromatography and cation exchange chromatography. The purity of the target protein was more than 95%, and the endotoxin was less than 30EU/mg. The invention not only has important value for some proteins which are not suitable for ultrafiltration and filtration, but also saves the processing time for other proteins and improves the recovery rate of the target protein. The target protein obtained by the method described in the present invention, or a composition containing a target protein and a pharmaceutical acceptor, can be used for various diagnosis, treatment or other uses known to such target proteins and compositions, such as preparation of human vaccine products.

【技术实现步骤摘要】
一种目的蛋白的纯化方法
本专利技术涉及蛋白质纯化，具体地说，涉及一种目的蛋白的纯化方法。
技术介绍
生物制药技术日新月异，为人类健康事业发挥了巨大作用，大规模，经济的纯化技术是其中关键的环节，直接决定了产品质量。生物制药蛋白质药物与疫苗一般利用真核或原核细胞系表达，该细胞系被工程化为含有编码目的蛋白基因的重组质粒表达目的蛋白。由培养基和副产品的混合物中分离纯化出所需目的蛋白到足够的纯度，又要保证回收率以保持一定生产能力，对于生物制品纯化人员来说，无疑是巨大的挑战。由于蛋白质的药物生产必须符合药典规定，包括严格的纯度要求，所含杂质很低，因此，对于细菌表达的重组蛋白制品，前处理通常包括较多步骤，如离心，超滤，硫酸铵沉淀等，去除细菌碎片和初步纯化以减轻后续纯化压力。一般来说，在使用层析柱进行层析处理前，样品需要经过过滤膜死端过滤，通常为0.22微米孔径或0.45微米孔径，以保证样品对于层析柱内的层析填料不会造成堵塞，对于大多数样品，离心，超滤，过滤膜等步骤都是必须和适当的，这几个步骤成为了细菌表达的重组蛋白制品通常的前处理方法。但是，由于不同蛋白性质不同，有些蛋白会堵塞超滤膜孔，造成超滤和过滤困难，尽管有例如批次吸附技术等解决这一问题，但由于需要特殊设备，若能在层析柱上实现不需要超滤和过滤即可上柱，将大大简化纯化流程以及减少产物损失，以达到回收率和产率要求。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种目的蛋白的纯化方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种从包含目的蛋白和至少一种污染物的混合物中纯化目的蛋白的方法，将所述混合物先后进行阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤，即可实现目的蛋白的分离纯化。进一步地，所述混合物为宿主细胞表达的含目的蛋白的发酵产物，例如，可以是细菌表达的重组胞内蛋白发酵液。所述宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞或动物细胞等。优选大肠杆菌。进一步地，所述目的蛋白为宿主细胞表达的胞内蛋白，优选为可广泛被基因工程化来表达的的蛋白，尤其是胞内蛋白。例如，前文所述的细菌表达的重组胞内蛋白发酵液，可为将目的蛋白的DNA导入宿主细胞后，经宿主细胞发酵所得的含有重组胞内蛋白的发酵液。进一步地，所述污染物选宿主细胞胞内蛋白、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成蛋白质、核酸、内毒素、产物相关的污染物、脂质、培养基添加物或培养基衍生物中的一种或多种。进一步地，所述阴离子交换层析在pH为为4～10，且电导率为0.1～10mS/cm的条件下进行，优选pH值为7～9且电导率为0.5～5mS/cm。进一步地，所述阴离子交换层析在pH值为3～10，且电导率为0.1～40mS/cm的条件下进行，优选pH值为4～9且电导率为0.5～15mS/cm。进一步地，所述阴离子交换层析柱的填料粒径不小于75μm。可选的，所述阴离子交换层析柱为QSepHaroseBigBeads，QSepHaroseXL，TOYOPEARLGigaCapQ-650M，TOYOPEARLGigaCapDEAE-650M或UNOspHereQ，它们的填料粒径分别为200μm，90μm，75μm，75μm，120μm，大孔径的设计，使它们可以承受粗制发酵液上样造成的粘度，从而实现较低的反压，因而对于仅经过离心去除细菌碎片处理，而不进行超滤和过滤处理的样品处理成为可行。此外，这几款填料还具有高结合载量，具有较高线性流速，可满足重复的在位清洗，具有良好的化学稳定性的特点，这些共同的特点能够实现可靠的高产率和批间稳定性，对于生物医药生产来说，是必不可少的。可选的，所述阳离子交换层析柱的填料选自以下填料之一：日本东曹生物科技有限公司的TOYOPEARLGigaCapS-650M，TOYOPEARLSP-650S，M，C，TOYOPEARLSP-550C，TOYOPEARLCM-650S，M，C，TOYOPEARLMegaCapIISP-550EC，美国伯乐公司的25SResin，HighSResin，CMResin，UNOspHereTMSMedia，SOURCE15S，SOURCE30S，美国GE公司的SPSepHaroseHP，SPSepHaroseFF，SSepHaroseFF，CMSepHaroseFF，CaptoS，CaptoSImpact。经过阳离子交换层析后，目标蛋白被进一步纯化，已达到内毒素小于30EU/mg和目标蛋白纯度大于95％的要求。作为优选，在混合物进行阴离子交换层析之前，对混合物进行匀浆破碎，但无需进行切向流过滤和/或滤器死端过滤等过滤或超滤步骤。所述匀浆破碎聚体可为按照1:15-1:5的比例，向所述混合物中加入破碎液，低温匀浆破碎400bar-800bar。破碎后4000-6000g离心10-20分钟，弃沉淀，取上清液。本专利技术还提供了一种制备目的蛋白的方法，培养可表达目的蛋白的宿主细胞，将所述宿主细胞和/或其产物利用本专利技术所述纯化方法，分离纯化目的蛋白。本专利技术还提供了所述纯化方法在制备基因工程化表达重组胞内蛋白质中的应用。作为优选，所述重组胞内蛋白质用于制备疫苗。在本专利技术的具体实施例中，以示例性说明记载了本专利技术所述方法对大肠杆菌发酵液中目的蛋白的纯化过程。大肠杆菌表达系统是生物制药中十分常见且成熟的表达系统，其优势为繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定、成本低廉。但其也存在部分劣势，如细胞周质内含有种类繁多的内毒素，为目的蛋白的纯化带来较大难度。由于不同的蛋白质表达方法不同，一些蛋白质直接由细胞分泌到周围的培养基中，另外的蛋白质则被保留在细胞内。对于后者，产生于细胞内的蛋白质，需要利用比如高压均质破碎，酶处理等方法使其细胞裂解，因此，细胞内其他杂质也同时被释放到匀浆中。对于前者，由于细胞的自然死亡和宿主细胞内蛋白质的释放，分泌的蛋白质也会产生前述问题，虽然程度比前者要小得多。因此，对于大肠杆菌表达重组胞内蛋白质，常规技术的前处理方法是经过高压均质等方法破碎后，先离心去除细胞碎片或裂解片段等杂质，然后通过超滤和死端过滤进行进一步前处理，以满足上层析填料的要求。本专利技术所述方法，格外适宜对保留在细胞内的目的蛋白的分离纯化，可有效减少纯化产物中细胞内其他杂质的残留。根据本专利技术所述纯化方法，一旦获得含有目的蛋白的混合物，即通过大肠杆菌胞内表达的重组蛋白质，即可如上文所述，破碎细菌细胞后，经过离心，获得上清液，在适当条件下利用粒径较大的阴离子交换层析填料与接下来的阳离子填料纯化，即可实现混合物中污染物的分离。本专利技术方法的前处理不需要TFF与死端过滤，仅需要将大肠杆菌破碎后离心，既满足层析步骤对于杂质处理的要求。本专利技术的层析步骤可以在柱上进行。尽管前处理没有经过TFF与死端过滤，在层析柱中仍可以满足压力低于承受值，一般为0.3MPa，且在层析柱内的上样、清洗、洗脱、再生流速不受影响。如有必要，依照本专利技术所述方法纯化得到的目的蛋白可进行额外的再处理(包括再纯化)步骤。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种从包含目的蛋白和至少一种污染物的混合物中纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从包含目的蛋白和至少一种污染物的混合物中纯化目的蛋白的方法，其特征在于，对混合物进行破碎、离心后，依次进行阴离子交换层析和阳离子交换层析，分离获得纯化的目的蛋白；其中，进行阴离子交换层析时，填料粒径不小于75μm。

【技术特征摘要】
1.一种从包含目的蛋白和至少一种污染物的混合物中纯化目的蛋白的方法，其特征在于，对混合物进行破碎、离心后，依次进行阴离子交换层析和阳离子交换层析，分离获得纯化的目的蛋白；其中，进行阴离子交换层析时，填料粒径不小于75μm。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物为宿主细胞表达的含目的蛋白的发酵产物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为宿主细胞表达的胞内蛋白，优选为通过基因工程手段重组的胞内蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为大肠杆菌表达的重组胞内蛋白质。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述污染物选自其他宿主细胞胞内蛋白、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成蛋白质、核酸、内毒素、产物相关的污染物、脂质、培养基添...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟夏萌，张静飞，郭林，刘建东，刘建凯，郑海发，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11