本发明专利技术涉及通过从含有聚乙二醇化蛋白质的样品中去除杂质来纯化聚乙二醇化蛋白质(特别是，但不专指维生素K依赖性凝血因子例如因子IX (FIX))的方法，涉及用所述方法纯化的蛋白质，以及涉及所述纯化后的蛋白质在治疗中的用途，特别但并非唯一地涉及所述纯化后的蛋白质在用于治疗由凝血因子减轻的疾病中的用途，所述治疗例如血友病的预防性治疗。
Methods for purification of PEGylated proteins
The present invention relates to the removal of impurities from containing pegylated protein samples for purification of PEGylated proteins (especially, but not exclusively vitamin K dependent coagulation factors such as factor IX (FIX)) method involves using the method of protein purification, and relates the use of purified protein in the treatment of in particular, but not only relates to the purified protein in use for the treatment of the disease is alleviated by the coagulation factor in the treatment of preventive treatment, such as hemophilia.
【技术实现步骤摘要】
纯化聚乙二醇化蛋白质的方法本申请是申请日为2010年11月24日，申请号为201080053284.0，专利技术名称为“纯化聚乙二醇化蛋白质的方法”的专利技术专利的分案申请。专利
本专利技术涉及通过从含有聚乙二醇化(PEGylated)蛋白质的样品中去除杂质来纯化聚乙二醇化蛋白质(特别是，但不专指维生素K依赖性凝血因子例如因子IX(FIX))的方法，涉及用所述方法纯化的蛋白质，以及涉及所述纯化后的蛋白质在治疗中的用途，特别但并非唯一地涉及所述纯化后的蛋白质在用于治疗由凝血因子减轻的疾病中的用途，所述治疗例如血友病的预防性治疗。专利技术背景凝血是包括多种血液组分或因子的复杂相互作用的过程，这最终导致血纤蛋白血块。通常，参与被称为凝血“级联”的血液组分为酶原(proenzyme或zymogen)，即通过激活剂的作用而被转变为蛋白水解酶的无酶活的蛋白，所述激活剂本身为活化凝血因子。经过所述转变后的凝血因子通常情况下称作“活性因子”，并通过加上小写“a”后缀来命名(例如因子VIIa)。需要活化因子("Xa")来将凝血酶原转变为凝血酶，其随后将血纤蛋白原转变为血纤蛋白，这作为形成血纤蛋白血块的最后阶段。有两个系统或途径促进因子X的活化。“内源途径”是指通过利用仅存在血浆中的因子而致使凝血酶生成的那些反应。一系列由蛋白酶介导的活化最终生成因子IXa，其与因子VIIa一起将因子X裂解为因子Xa。相同的蛋白水解通过在凝血的“外源途径”中的因子VIIa与其辅因子，组织因子来实现。组织因子为膜结合蛋白，并且通常不在血浆内循环。然而当血管破裂时，在Ca2+与磷脂存在下，其可与因子VIIa复合以催化因子X活化或因子IX活化。两种凝血途径在止血中的相对重要性尚不明确。因子IXa(FIXa)是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其通过生成作为X酶复合物一部分的大多数因子Xa而在止血过程中发挥关键作用，凝血期间需要所述因子Xa来支持凝血酶的正确生成(HoffmanM和MonroeD.M.,III(2001)Acell-basedmodelofhemostasis.ThrombHaemost85,958-965中的综述)。因子IXa活性的先天性缺乏是X-连锁的出血障碍血友病B的原因，所述血友病B影响约1:100,000的男性。这些血友病患者目前主要通过用重组或血浆-来源的凝血因子IX的替代疗法来治疗。因子IX为维生素K依赖性凝血因子，其在结构上与因子VII、因子X和蛋白C相似。血浆半衰期为约18至30小时的循环的酶原形式由415个氨基酸组成，其可分为4个不同的结构域，所述结构域包括N末端的富含γ-羧基谷氨酸(Gla)结合域，两个EGF结构域，和C末端胰蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶结构域。因子IX的活化通过以下而发生：在Arg145-Ala146和Arg180-Val181的有限蛋白水解释放35个氨基酸的片段，即所谓的激活肽(SchmidtA.E.和BajajS.P.(2003)Structure-functionrelationshipsinFactorIXandFactorIXa.TrendsCardiovascMed13,39-45)。此激活肽高度糖基化，其包含个N连接和多达4个O连接聚糖。蛋白质循环半衰期的延长可通过修饰蛋白质天然结构来实现。聚乙二醇化是已建立的一种用于延长蛋白质的循环半衰期的方法。因子IX(FIX)的糖聚乙二醇化(GlycoPEGylation)生成多种聚乙二醇化物质，例如单、二和三-聚乙二醇化物质。如此的组合因而为形成多种单聚乙二醇化和二聚乙二醇化物质提供了可能性。单聚乙二醇化形式已被鉴定为具有期需的药理学概况(profile)，并因而被选为优选的药物候选物。因此，从聚乙二醇化和非聚乙二醇化物质的混合物中分离单聚乙二醇化形式是期需的。除了聚乙二醇化物质彼此分离及其与非聚乙二醇化物质的分离之外，纯化过程还必须提供充分减少的反应中所使用试剂。开发一种保证期需产物质量的方法是必要的，并且将有利的是，开发可提供充分减少的过程相关杂质(例如聚乙二醇化试剂、酶、来自试剂的副产物)以及产物相关杂质(例如非聚乙二醇化物质)的单个步骤纯化。US2008/207879(BaxterInt)描述了rFIX的纯化过程，其包括将产物加入阴离子交换柱，和用超过200mM的盐浓度洗柱子，以及用包含二价阳离子的洗脱缓冲液洗脱。专利技术概述根据本专利技术的第一方面，提供了纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于，所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。根据本专利技术的第二方面，提供了纯化的聚乙二醇化因子IX凝血因子，其可通过本文阐述的方法获取。附图简述图1展示了用本专利技术纯化方法所得到的色谱图。专利技术详述根据本专利技术的第一方面，提供了纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于，所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。本专利技术的纯化方法相较于之前描述的纯化方法拥有众多优势。意想不到地发现，在洗涤期间尽管存在酸性缓冲液，但聚乙二醇化蛋白质(例如FIX)仍然与树脂结合。迄今为止纯化因子(聚乙二醇化蛋白质浓度与杂质浓度之比)意想不到地高。例如在本专利技术中，所得级分中ST3Gal3的含量显著降低。ST3Gal3为在糖聚乙二醇化过程期间使用的聚乙二醇化酶。在所得级分中存在此酶显然是非期需的，这是因为在接下来的纯化过程中可出现进一步聚乙二醇化。此外，将残余的酶视为杂质，并且在单聚乙二醇化rFIXa的药物制剂中将残余的酶量降到非常低的水平是期需的。本专利技术的酸性洗涤步骤还提供了灭活样品中可能存在的任何pH敏感病毒的优势。本专利技术还提供了使单个色谱步骤的纯化得以进行的额外优势。聚乙二醇化蛋白质可通过文献中已知且本领域技术人员已知的方法之一获得。WO2005/055950和WO2006/127896描述了FIX的聚乙二醇化方法，其中将PEG基团经酶连接到糖基上。用本专利技术方法进行纯化的聚乙二醇反应混合物可经由糖聚乙二醇化或其它已知的聚乙二醇化方法获得。尽管聚乙二醇化蛋白质的纯化构成本专利技术的特定方面，但所述方法亦可同样应用于与除PEG外的聚合物(例如聚唾液酸)连接的蛋白质纯化。在一个实施方案中，所连接的PEG基团大小在约2至约40kD之间变化。在一个实施方案中，通过酸性洗涤步骤去除的杂质为ST3Gal3。在一个实施方案中，杂质去除步骤包括用pH在3.8至5.0之间(即在下列任一pH：3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0)，例如在4.0至4.5之间(即在下列任一pH：4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5)，例如在4.0至4.4之间，特别为4.1至4.3之间，更特别为4.1、4.2或4.3的酸性缓冲液洗涤。在低于4.5的pH下进行杂质去除步骤的优势为由于存在Ca2+结合结构域，聚乙二醇化蛋白质在所述pH下将紧密地结合，因此，酸性洗涤可用于降低等电点高于聚乙二醇化蛋白质的其它杂质浓度。将理解的是，缓冲液包含任何能够降低pH值至约4.5以下的合适缓冲液，然而，适宜地所本文档来自技高网...
【技术保护点】
纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于，所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。
【技术特征摘要】
2009.11.24 EP 09176881.2;2009.11.25 US 61/2644861.纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于，所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。2.权利要求1阐述的方法，其中所述杂质为ST3Gal3。3.权利要求1或权利要求2阐述的方法，其中所述杂质去除步骤包括使用pH3.9至4.5、4.0至4.5或4.0至4.4之间的酸性缓冲液洗涤。4.前述权利要求中任一项阐述的方法，其中所述酸性缓冲液包含乙酸钠和/或乙酸，例如50mmol乙酸钠和140mmol乙酸。5.前述权利要求中任一项阐述的方法，其中平衡化步骤在酸性洗涤步骤之前实施。6.权利要求5阐述的方法，其中所述平衡化步骤包括pH在5至7之间的平衡缓冲液的施用。7.权利要求5或权利要求6阐述的方法，其中所述平衡缓冲液包含乙酸钠和乙酸，例...
【专利技术属性】
技术研发人员：MKD韦恩达尔，L塞耶斯加尔德，A博格斯内斯，
申请(专利权)人：诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH
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