对虾肝胰腺细小病毒（HPV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂技术

本发明专利技术公开了一种对虾肝胰腺细小病毒（HPV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到2fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent for shrimp hepatopancreas parvovirus (HPV)

The invention discloses a shrimp liver pancreas parvovirus (HPV) RAA constant temperature fluorescence detection method and a detection kit. The detection kit includes a positive primer SEQ ID NO.1, a reverse primer SEQ ID NO.2, a specific fluorescent probe SEQ ID NO.3, a reaction liquid, a recombinant polymerase and a control product. The kit has strong specificity, high detection sensitivity, can reach 2fg/ mu L, high accuracy, reliable, simple and quick operation, suitable for field detection, and has extensive application scene.

【技术实现步骤摘要】
对虾肝胰腺细小病毒(HPV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾肝胰腺细小病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
肝胰腺细小病毒(HepatopancreaticParvovirus,HPV)主要感染对虾之后尾幼虫(postlarvae)及稚虾，一般病虾外观无明显特异症状，幼体虾被感染后行动不活泼、食欲减退、生长缓慢、很少蜕皮，体表常有许多共栖性生物或杂物附着；养殖期的幼虾或成虾，虾体瘦弱、体色较深，有些罹病虾体甲壳表面有大量黑色斑点，有时甲壳变软、腹部肌肉变白，抗逆性能力差，常并发二次性细菌感染，以弧菌(Vibriospp.)最常见，有时罹病虾体除继发性细菌感染外被感染的草虾(P.monodon)常可检出草虾杆状病毒(Monodonbaculovirus,MBV＝PmSNPV)及白斑综合症候群病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)。(UmeshaRKetal,2003,R)，造成甚大的死亡，其死亡率达50～90％，并随着虾体增长，病情减轻；种虾多呈隐性感染而带病毒。虾肝胰腺细小病毒感染之靶的器官为肝胰腺管远盲端上皮E细胞及前中肠后段上皮细胞，并在细胞核内进行复制，且破坏组织细胞。肝胰腺细小病毒为单股DNA病毒(Single-StrandDNA)，在细胞核内增殖并形成圆形或卵圆形包涵体(inclusionbody)，经Feulgen氏染色呈阳性反应，病毒颗粒大小随感染虾种而有差异；如感染草虾肝胰腺病毒颗粒为22-24nm(Lightner&Redman,1985)、感染巴拿马对虾(bananashrimp,Penaeus＝Fenneropenaeusmerguiensis)，肝胰腺病毒颗粒为21-22nm(Roubaletal.1989)、感染斑节虾(kurumashrimp,P.＝Marsupenaeusjaponicus)、肝胰腺病毒颗粒为17-20nm(Spannetal,1997)，平均病毒颗粒为22-24μm。现在常用的检测方法为PCR-电泳法，操作复杂。另外，PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于对虾现场普及推广使用。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供对虾肝胰腺细小病毒(HPV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种对虾肝胰腺细小病毒(HPV)核酸的检测试剂盒，包括：对虾肝胰腺细小病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾肝胰腺细小病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾肝胰腺细小病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、对虾肝胰腺细小病毒标准品和ddH2O中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，对虾肝胰腺细小病毒标准品为含有对虾肝胰腺细小病毒保守区基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有对虾肝胰腺细小病毒保守区基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种对虾肝胰腺细小病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在对虾肝胰腺细小病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对虾肝胰腺细小病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾肝胰腺细小病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾肝胰腺细小病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾肝胰腺细小病毒阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本专利技术对对虾其他的病症对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、对虾虹彩病毒(SIV)、对虾肝肠胞虫(EHP)的DNA均不发生扩增。4、高灵敏度：本专利技术的检测极限可以达到2fg/反应5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。附图说明图1为本专利技术中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。图2为RAA检测方法对HPV的灵敏度实验图，从左到右依次为2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对虾肝胰腺细小病毒（HPV）核酸的检测试剂盒，包括：对虾肝胰腺细小病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾肝胰腺细小病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述对虾肝胰腺细小病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种对虾肝胰腺细小病毒（HPV）核酸的检测试剂盒，包括：对虾肝胰腺细小病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾肝胰腺细小病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾肝胰腺细小病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、对虾肝胰腺细小病毒标准品和ddH2O中至少一种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。5.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，钱冬，黄震巨，张建勋，肖文，余国君，陶智勇，徐锦余，霍胜楠，沈弘，郑晓叶，郑天伦，沈伟良，吕文浩，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33