用于检测生物污染物的组合物和方法技术

本文提供了用于确定微生物污染物是否存在于生物治疗生产过程中的组合物和方法。具体地，提供了人工阳性扩增对照质粒和特有定量PCR检测探针，其使得能够快速和实时检测假阳性结果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测生物污染物的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请根据35USC§119(e)要求于2015年3月27日提交的美国临时专利申请No.62/139,321的优先权，该申请通过引用整体具体地并入本文。专利
本专利技术一般涉及通过细胞培养制造生物分子的方法。本专利技术更具体地但非排他地涉及用于检测细胞培养物中的生物污染物的组合物和方法。专利技术背景生物药物，特别是治疗性抗体，通过哺乳动物细胞培养生产。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最常用的宿主细胞。这些生产系统易于发生外源性和内源性病毒感染，这为生物药物带来潜在的安全问题。因此，使用病毒清除程序和病毒载量测量来促进药物的安全性。用于减少病毒载量的步骤包括纳滤、通过热或pH保持的病毒灭活和色谱法。可以通过耗时的感染性测定或通过快速定量测定(如实时PCR或定量聚合酶链反应(Q-PCR))来监测病毒载量和病毒去除的有效性。Q-PCR需要适当的阴性和阳性对照使得其可靠。加入核酸提取对照以测试样品以控制适当的核酸提取。如果核酸提取对照在Q-PCR过程中为阴性或超出预期的回收范围，则样品被拒绝。相反，如果核酸提取对照在Q-PCR过程中为阳性或在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含人工核苷酸序列、荧光团和淬灭剂的组合物，其中人工核苷酸序列在其3’末端包含不超过五个连续核酸，其与SEQ ID NO：9和12‑37中任一个的序列相同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.27 US 62/139,3211.一种包含人工核苷酸序列、荧光团和淬灭剂的组合物，其中人工核苷酸序列在其3’末端包含不超过五个连续核酸，其与SEQIDNO：9和12-37中任一个的序列相同。2.权利要求1的组合物，其中荧光团选自具有495nm至680nm的任意激发波长和515nm至710nm的任意发射波长的荧光团。3.权利要求2的组合物，其中淬灭剂选自具有430nm至672nm的任意吸收峰的染料。4.权利要求1的组合物，其中荧光团具有495nm的激发波长和520nm的发射波长。5.权利要求4的组合物，其中荧光团是FAM。6.权利要求5的组合物，其中淬灭剂是BHQ-1。7.权利要求1的组合物，其中荧光团连接到人工核苷酸序列的5’末端，并且淬灭剂连接到人工核苷酸序列的3’末端。8.权利要求1的组合物，其中人工核苷酸序列包含SEQIDNO：3(5’-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3’)的核酸序列。9.一种组合物，包含：a.啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物；b.啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针；c.人工寡核苷酸检测探针；d.啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物；e.M13特异性正向寡核苷酸引物；f.M13特异性寡核苷酸检测探针；和g.M13特异性反向寡核苷酸引物。10.权利要求9的组合物，其中a、b和d的寡核苷酸序列各自包含啮齿动物细小病毒的NS-1序列，啮齿动物细小病毒选自小鼠细小病毒原型株(MVMp)，小鼠细小病毒免疫抑制株(MVMi)，小鼠细小病毒Cutter株(MVMc)；小鼠细小病毒1b(MPV-1b)，小鼠细小病毒1a(MPV-1a)，小鼠细小病毒1c(MPV-1c)，仓鼠细小病毒(HaPV)，Toolan's细小病毒(H-1)，Kilham大鼠病毒(KRV)，大鼠细小病毒1a，大鼠细小病毒和大鼠病毒L的Umass株(RV-Umass)。11.权利要求9的组合物，其中人工寡核苷酸检测探针包含核苷酸序列，核苷酸序列在其3’末端具有不超过五个连续核酸，其与SEQIDNO：9和12-37中任一个的序列相同。12.权利要求10的组合物，其中a、b和d的寡核苷酸序列与SEQIDNO：37杂交。13.权利要求9的组合物，其中b、c和f的每个检测探针包含荧光团和淬灭剂，使得每个检测探针的荧光团发射不同波长的光。14.权利要求13的组合物，其中每个探针的荧光团选自具有495nm至680nm的任意激发波长和515nm至710nm的任意发射波长的荧光团。15.权利要求14的组合物，其中淬灭剂选自具有430nm至672nm的任意吸收峰的染料。16.权利要求13的组合物，其中人工寡核苷酸检测探针(c)包含荧光团FAM和淬灭剂BHQ-1；啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针(b)包含荧光团VIC和小沟结合非荧光淬灭剂(MGBNFQ)；并且M13特异性寡核苷酸检测探针包含荧光团Cy5和淬灭剂BHQ2。17.权利要求12的组合物，其中啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物(a)包含SEQIDNO：1的核酸序列；啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物(d)包含SEQIDNO：4的核酸序列；并且啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针(b)包含SEQIDNO：2的核酸序列。18.权利要求11的组合物，其中人工寡核苷酸检测探针(c)包含SEQIDNO：3的核酸序列。19.权利要求9的组合物，其中M13特异性正向寡核苷酸引物(e)包含SEQIDNO：5的核酸序列；M13特异性寡核苷酸检测探针(f)包含SEQIDNO：6的核酸序列；M13特异性反向寡核苷酸引物(g)包含SEQIDNO：7的核酸序列。20.一种在测试样品中检测生物污染物的方法，包括以下步骤：a.混合成分以制备反应混合物，其中成分包含(i)衍生自测试样品的核酸样品，(ii)寡核苷酸，和(iii)DNA聚合酶；b.使反应混合物进行聚合酶链反应(PCR)；c.在PCR过程中监测(i)靶扩增多核苷酸(TAP)，(ii)核酸提取对照扩增多核苷酸(NACP)，和(iii)质粒扩增对照多核苷酸(PACP)的产生；和d.比较TAP的产生与NACP和PACP的产生，其中在PCR过程中产生的TAP的存在、NACP的存在和PACP的不存在表明测试样品含有生物污染物并且不含有阳性扩增对照质粒。21.权利要求20的方法，其中寡核苷酸包含(a)啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物，(b)啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针，(c)人工寡核苷酸检测探针，(d)啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物，(e)M13特异性正向寡核苷酸引物，(f)M13特异性寡核苷酸检测探针，(g)M13特异性反向寡核苷酸引物。22.权利要求20的方法，其中测试样品是从哺乳动物细胞培养物或其纯化部分获得的。23.权利要求20的方法，其中测试样品掺有M13K07噬菌体。24.权利要求20的方法，其中核酸样品通过使约1mL测试样品经历裂解、蛋白水解和热变性，然后将样品与提取对照样品组合，然后从样品提取核酸。25.权利要求24的方法，其中提取对照样品是M13K07噬菌体。26.权利要求25的方法，其中(a)啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物包含SEQIDNO：1的核酸序列；(b)啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针包含VIC荧光团、小沟结合非荧光淬灭剂(MGBNFQ)和SEQIDNO：2的核酸序列；(c)人工寡核苷酸检测探针包含FAM荧光团、非荧光淬灭剂BHQ和SEQIDNO：3的核酸序列；(d)啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物包含SEQIDNO：4的核酸序列；(e)M13特异性正向寡核苷酸引物包含SEQIDNO：5的核酸序列；(f)M13特异性寡核苷酸检测探针包含Cy5荧光团...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·曼伯艾赫，S·敏克，P·维希欧，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US