一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，特别涉及一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒。一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明专利技术提供的用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为定量检测禽流感病毒提供良好的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒。
技术介绍
禽流感(Avianinfluenza)是由A型流感病毒引起的一种人与动物共患病，不仅引起禽类以呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和高死亡率等为特征的烈性传染病，而且可导致人的感染和死亡，严重威胁人类健康。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)最显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁，按病原体类型的不同，可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报疾病。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种明录》将其列为一类动物疫病。检测禽流感的技术有酶联免疫(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)，目前比较主流的是PCR检测技术。PCR又分为普通PCR和荧光定量PCR两种，与普通PCR相比，荧光定量PCR操作简单、特异性更强、自动化程度更高。禽流感因为亚型比较多，一般的禽流感病毒H5、H7、H9都需要检测，所以建立一种禽流感H5、H7、H9三重荧光定量PCR试剂盒很有必要。然而一般的荧光定量检测前需要提取样本中的核酸，这就无形中增加了检测成本，降低了检测效率。因此，建立一种免核酸提取的禽流感H5、H7、H9三重荧光定量PCR试剂盒检测技术，具有重要的现实意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为检测禽流感病毒提供良好的基础。本专利技术的第二目的在于提供一种禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，为检测的进行提供便利。本专利技术的第三目的在于提供一种禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法，采用免核酸提取进行禽流感病毒的荧光定量PCR检测，节约检测成本，节约人力，并且三种亚型的病毒可以同时检测，根据探针5′端标记荧光报告基团的不同判断阴性和阳性，提高检测效率。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQIDNO：3所示；第二引物对如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQIDNO：6所示；第三引物对如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQIDNO：9所示。本专利技术提供的用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为定量检测禽流感病毒提供良好的基础。其中，第一引物对对应检测禽流感病毒H5亚型，第二引物对对应检测禽流感病毒H7亚型，第三引物对对应检测禽流感病毒H9亚型。进一步地，所述探针为自身淬灭探针。进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种。进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种。进一步地，所述核酸序列至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。由于不同的引物对及其相应的探针用于检测不同的禽流感病毒亚型，通过设置不同的探针5′端标记荧光报告基团，不同荧光报告基团在进行实时荧光定量检测时，吸收峰不同，据此，可同时检测不同的禽流感病毒亚型。经试验发现，不同的引物对对应的探针的报告基因具有偏好性，即不同探针采用特定的报告基团检测效果更佳。进一步地，所述第一引物对对应的第一探针的5′端标记荧光报告基团FAM；所述第二引物对对应的第二探针的5′端标记荧光报告基团Hex；所述第三引物对对应的第三探针的5′端标记荧光报告基团VIC。优选地，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1。本专利技术还提供了禽流感病毒的检测试剂盒，包括上述的核酸序列，即为上述引物对及其对应的探针中的一种或多种。本专利技术提供的禽流感病毒的检测试剂盒，为检测的进行提供便利。进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。进一步地，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mMEDTA、TritonX-1000.8～1.2v/v％、NP-401.5～2.5v/v％、CHAPS35～45g/L、2～3mMDTT、SDS41～51g/L以及50～70mMNaCl；优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、TritonX-1000.8～1.2v/v％、0.15～0.25mMPMSF、1.7～2.3mMDTT、pharmalyte1.7～2.3v/v％以及100～120mMNaCl。进一步地，所述试剂盒包括盒体，所述盒体内设置有带有孔的衬垫；不同的试剂放置在贴有不同颜色标签或不同颜色的容器中，所述容器插入所述孔中，所述孔的个数不小于容器的个数。本专利技术提供的试剂盒，通过容器如瓶的颜色或者标签的不同，更好的区分放入的组成成分是否正确，减少出错几率。优选地，所述衬垫优选为高密性发泡模具。高密性发泡模具，具有固定、缓冲、支撑的作用。本专利技术还提供了禽流感病毒的检测方法，待检测病毒的核酸以上述的核酸序列进行实时荧光定量PCR检测。进一步地，所述待检测病毒的核酸通过以下步骤制备：取待检测物，加入裂解液，振荡，然后加入中和液，混匀，离心，得到的上清液即为所述待检测病毒的核酸；所述裂解液的主要成分为：13～17mMEDTA、TritonX-1000.8～1.2v/v％、NP-401.5～2.5v/v％、CHAPS35～45g/L、2～3mMDTT、SDS41～51g/L以及50～70mMNaCl；所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、TritonX-1000.8～1.2v/v％、0.15～0.25mMPMSF、1.7～2.3mMDTT、pharmalyte1.7～2.3v/v％以及100～120mMNaCl。进一步地，所述裂解液与所述中和液的添加比例为1:1±0.1；进一步地，所述待检测物包括禽类咽喉腔拭子采集物、泄殖腔拭子采集物、血液、血清、血浆、组织。其中，液体类(血液、血清或血浆样本)的待检测物取10-50μl，加入4-6倍的裂解液，振荡后加入与裂解液等体积的中和液，混匀，离心，取50-120μl的上清液进行荧光定量PCR检测即可；相应地，对于固体组织来说，取1-5mg的组织进行研磨，然后加入1mlPBS溶液混匀，离心取10-50μl，加入4-6倍的裂解液，振荡后加入与裂解液等体积的中和液，混匀，离心，取50-120μl的上清液进行荧光定量PCR检测即可；相应地，对于固咽喉腔拭子、泄殖腔拭子来说，取样后，离心取10-50μl，加入4-6倍的裂解液，振荡后加入与裂解液等体积的中和液，混匀，离心，取50-120μl的上清液进行荧光定量PCR检测即可。进一步地，本申请提供的待检测物采用上述的核酸序列同时实时荧光PCR检测。反应体系为：样本2μl，反应液10μl，逆转录酶2μl，引物探针混合液5.4μl，无核酸水0.6μl，总体积是20μl。引物探针混合物中，含有第一引物对以及对应的探针、第二引物对以及对应的探针和第三引物对以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQIDNO：3所示；第二引物对如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQIDNO：6所示；第三引物对如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQIDNO：9所示。2.根据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述探针为自身淬灭探针；进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团；进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种；进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种。3.根据权利要求1-2任一项所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。4.根据权利要求3所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述第一引物对对应的第一探针的5′端标记荧光报告基团FAM；所述第二引物对对应的第二探针的5′端标记荧光报告基团Hex；所述第三引物对对应的第三探针的5′端标记荧光报告基团VIC；优选地，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1。5.禽流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的核酸序列；进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。6.根据权利要求5所述的禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mMEDTA、TritonX-1000.8～1.2v/v％、NP-401.5～2.5v/v％、CHAPS35～45g/L、2～3mMDTT、SDS41～51g/L以及50～70mMNaCl；优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、TritonX-1000.8～1.2v/v％、0.15～0.25mMPMSF、1.7～2.3mMDTT、pharmalyte1.7～2....

【专利技术属性】
技术研发人员：李杰超，魏园园，王红伟，冯小宇，彭蓉，
申请(专利权)人：北京大有泰莱生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11