一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR‑RFLP方法技术

本发明专利技术提供一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR‑RFLP方法，本发明专利技术的方法仅需上游引物F和下游引物R（SEQ ID NO.1‑2所示），并仅需常规限制性内切酶Hind III进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发明专利技术在禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株快速鉴别诊断检测上快捷准确，解决目前尚未能解决的区别商品化弱毒疫苗毒与野毒株的难题，可以对我国广泛使用疫苗株WF100的养殖场进行禽坦布苏病毒检测与疾病的诊断以及实验研究中这些病毒株的相互鉴别。

【技术实现步骤摘要】
一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法
本专利技术涉及兽医传染病快速诊断
，特别涉及一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法。
技术介绍
禽坦布苏病毒病是一种禽坦布苏病毒（Tembusuvirus,TMUV）引起蛋鸭和种鸭产蛋量骤然下降，甚至绝产的烈性传染性疾病之一。患病的高产蛋率（如95%以上）蛋鸭和种鸭，发病后1周内从产蛋率迅速下降至10%以内，严重的于10天停产，这给我国养鸭业带来了灾难性的打击。目前国内对禽坦布苏病的预防主要是唯一一种商品化的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株（WF100株）。存在的问题是：首先蛋鸭在免疫之后的7天左右才产生良好的细胞免疫和体液免疫应答的能力，而一般情况下蛋鸭免疫完就暴露在可能存在禽坦布苏病毒强毒株的环境里，其次免疫接种不能阻止强毒感染和给鸭提供完全保护，疫苗毒与强毒可以在鸭体内长期共存。禽坦布苏病毒疫苗株（WF100株）的使用给禽坦布苏病毒病的确切诊断带来很大的困难，而目前缺乏区分商品化弱毒疫苗毒株与野毒株的鉴别方法，因此建立区分禽坦布苏病毒疫苗株与野毒株的鉴别方法迫在眉睫。目前在Genbank里录入的我国分离的禽坦布苏病毒野毒株（含鸭源、鸡源、鹅源和鸽源毒的毒株）在NS5基因中均存在核苷酸AAGCTT（HindIII酶切位点），而疫苗毒株（WF100株）在相对应位置的核苷酸为AAGCCT。同时RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）是近年来以基因位点差异而引起内切酶位点不同的一种分子生物学标记技术，已广泛应用于真核细胞基因组种群内、种群间（基因差异往往很小）的分型研究工作中，应用RFLP技术可对DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点进行分析。因此，我们设计1组引物并结合禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株的核苷酸特征，利用HindIII酶进行RFLP酶切分析对禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株进行鉴别诊断。本专利技术检测方法快捷准确，该PCR-RFLP方法可填补国内外相关领域研究空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，设计1组引物并结合禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株的核苷酸特征，利用HindIII酶进行RFLP酶切分析对禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株进行鉴别诊断。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP引物，所述的引物为：上游引物F：5’-TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT-3’，下游引物R：5’-CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC-3’。利用所述引物建立的区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，所述方法包括如下：（1）RT-PCR扩增反应体系为提取的病毒RNA模板2μL、10μM上游引物F1μL、10μM下游引物R1μL、2×One-StepReactionMix20μL、TransScriptⅡOne-StepEnzymeMix1μL，补充灭菌去离子水15μL至终体积40μL；RT-PCR扩增反应条件为：50℃反转录30min后进行PCR扩增，条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存备用；（2）将RT-PCR产物经胶回收后，利用RFLP进行HindIII酶切分析；酶切反应体系30μL，其中RT-PCR胶回收产物20μL、10×QuickCutBuffer3μL、QuickCutHindIII酶1μL，补充灭菌去离子水6μL至终体积30μL；反应条件：37℃水浴反应10min。所述的引物在制备区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株试剂盒中的应用。本专利技术的优点在于：其仅需上游引物F和下游引物R，并仅需限制性内切酶HindIII进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程。禽坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株与强毒株的致病性差异很大，但其基因组很相似，疫苗株（WF100株）的使用给禽坦布苏病毒的确切诊断带来很大的困难。本专利技术所建立的方法能区分禽坦布苏病毒疫苗WF100株与野毒株的鉴别方法。解决目前尚未能解决的区别商品化弱毒疫苗毒与野毒株的难题，可以对我国广泛使用疫苗株WF100的养殖场进行禽坦布苏病毒检测与疾病的诊断以及实验研究中这些病毒株的相互鉴别。这对于调查鸭群出现禽坦布苏病毒病免疫失败的原因、调查鸭群早期感染野毒、疫病的流行病学以及临床减蛋病的确切诊断、环境病毒的检测和禽坦布苏病毒病的预防与控制具有重要的意义及应用价值。附图说明图1NS5基因的RT-PCR检测结果。图2限制性内切酶HindIII酶切结果。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本专利技术。以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。实施例11、提取病毒的核酸RNA；（1）病毒来源：禽坦布苏病毒野毒株代表株（WR株）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存；鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株为齐鲁动物保健品有限公司生产的鸭坦布苏病毒病活疫苗（WF100株）（批准文号：兽药生字150252276）。（2）提取病毒RNA：用常规方法分别提取禽坦布苏病毒野毒株代表株（WR株）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株（WF100株）的核酸RNA，以备RT-PCR扩增使用。2、RT-PCR扩增（1）扩增引物的设计和选择：根据禽坦布苏病毒野毒株和弱毒疫苗毒株NS5基因特征设计上游引物F和下游引物R，其中，引物的序列如下：上游引物F：5’-TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT-3’，下游引物R：5’-CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC-3’。如图1所示：本专利技术设计的上下游引物扩增区域对禽坦布苏病毒野毒株和弱毒疫苗毒株NS5基因的扩增区域存在核苷酸差异（我国在Genbank登入的禽坦布苏病毒野毒株基因NS5核苷酸序列均为AAGCTT（HindIII酶切位点）），而鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗毒株为AAGCCT。（2）RT-PCR扩增：用上述设计的特异性引物F和R进行RT-PCR扩增，扩增反应体系如下：采用TransScriptⅡOne-StepRT-PCRSuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司)推荐的RT-PCR扩增反应体系（40μL，见表1）。其中，提取的病毒RNA模板2μL、上游引物F（10μM）1μL、下游引物R（10μM）1μL、2×One-StepReactionMix20μL、TransScriptⅡOne-StepEnzymeMix1μL，补充灭菌去离子水15μL至终体积40μL。表1：RT-PCR反应体系RT-PCR扩增反应条件为：50℃反转录30min后进行PCR扩增。条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存备用。（3）凝胶电泳检测：扩增产物用常规的琼本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR‑RFLP引物，其特征在于：所述的引物为：上游引物F：5’‑ TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT ‑3’，下游引物R：5’ ‑CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP引物，其特征在于：所述的引物为：上游引物F：5’-TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT-3’，下游引物R：5’-CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC-3’。2.利用权利要求1所述引物建立的区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述方法包括如下：（1）RT-PCR扩增反应体系为提取的病毒RNA模板2μL、10μM上游引物F1μL、10μM下游引物R1μL、2×One-StepReactionMix20μL、TransScriptⅡOne-StepEnzymeMix1μL，补充灭菌去离子水...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅秋玲，万春和，傅光华，黄瑜，施少华，程龙飞，陈红梅，刘荣昌，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35