快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了本发明专利技术涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒，属生物技术领域，筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，即上游引物<210>2和下游引物<210>3，通过所述的引物进一步建立了快速检测ASFV核酸的RPA检测系统。与普通PCR方法相比，RPA‑LFA具有以下优势：首先，RPA‑LFA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应。其次，RPA‑LFA检测速度快，反应时间在40min，比常规PCR反应时间要短。第三，可实现检测结果的可视化，这些特点使得本发明专利技术建立的RPA‑LFA方法可以用于基层单位普通实验室ASFV快速检测和鉴别诊断。

【技术实现步骤摘要】
快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒
本专利技术涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒，属生物

技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)又称非洲猪瘟疫，是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)感染引起的一种严重危害猪及野猪的急性、高度接触性传染病，其病程短，死亡率高达100％，是目前对世界养猪业危害最严重的烈性传染病之一。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求报告的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中ASFV被列为一类动物病原微生物。我国是以农业为主的养猪大国之一，目前虽然没有发生本病的报道，但与我国接壤的俄罗斯多次发生该病，中俄之间频繁的畜产品贸易往来导致该病输入我国的风险不断增加。同时，由于ASF在临床上和猪瘟(CSF)难以鉴别诊断，目前我国对ASF防控只能依赖于严格的疫病检疫和监测措施。因此，研发ASFV快速检测方法对于防止ASF传入我国具有十分重要的意义。ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)成员，也是目前已知唯一的虫媒DNA病毒。ASFV基因组为线性双链DNA，大小约为170～193kb，编码151～167个病毒蛋白。ASFV快速检测方法对于防控ASF具有重要的意义，但国内尚没有商品化ASFV快速检测试剂盒。目前，ASFV的检测主要通过病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等方法。然而，ASFV的分离需要在三级生物安全(BSL-3)以上的高级别实验室中进行，不适合于基层单位普通实验室应用。在血清学检测上，荧光抗体试验(FAT)是检测ASFV感染的常用方法，通过利用荧光素标记的抗ASFV特异性抗体检测病料中的ASFV抗原，可用于可疑猪或实验室接种猪病变组织的ASFV抗原检测。虽然该方法具有快速、敏感和特异的优点，但是需要昂贵的荧光显微镜、高质量的荧光标记抗体和专业的实验员，目前该方法仅作为诊断ASF的辅助检测方法。双抗体夹心阻断ELISA也是检测ASFV感染的一种血清学检测方法，该方法利用特异性的ASFV单克隆抗体包被酶标板，加入待检样本后，如果样本中含有ASFV抗原，则ASFV抗原与单抗特异性结合，再加入ASFV抗原另一表位的酶标单抗，形成双抗体夹心复合物，加入底物显色后指示样本中是否含有ASFV抗原。Vidal等以抗ASFVP72蛋白的单克隆抗体建立了夹心ELISA方法。西班牙生产了INGENASA夹心ELISA试剂盒，以包被的P72单抗检测病死猪血液及组织中的样本中的ASFV抗原，具有良好的特异性和敏感性，被OIE指定为ASFV检测的参考试剂盒。然而，该试进口试剂盒价格昂贵，限制了该试剂盒在我国的广泛使用。随着分子生物学的发展，国内外已经建立了检测ASFV核酸的常规RT-PCR、real-timeRT-PCR和巢式RT-PCR等多种分子生物学方法。常规RT-PCR方法具有商度的特异性和灵敏度、操作过程较为简单，并且其生物安全性较高，散毒危险小，且不需要对病原进行分离培养，广泛运用于ASFV的检测，被OIE列为ASFV的PCR标准检测方法。real-timeRT-PCR比常规PCR的检测更见快速和敏感，并且该检测在封闭体系中进行，不需进行电泳试验，避免了因电泳引起的交叉污染而造成假阳性，同时，也减少了EB的污染。巢式PCR方法涉及两次对PCR的扩増。先用外引物对其DNA模板进行特异性扩増，扩増产物为第二次扩増的模板，在进行内引物的PCR扩増。两次连续特异性扩増降低了因为靶位点过多而发生错配出现的非特异性扩增的可能，因此在灵敏度及特异化上，都较常规的PCR高，检测结果具有更好的准确性。然而，上述方法或需要昂贵的仪器设备，或需要技术娴熟的技术人员，或需要设计复杂的引物和探针，或反应试剂需要冷链运输和保存，不适合普通实验室的推广应用。2006年，一种新等温基因扩增技术--重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymeraseamplification，RPA)被专利技术。该技术可在37～42℃条件下、10～30min内等温体外大量扩增目的基因片段。随后，英国TwistDx公司开发出了RPA商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用。与聚合酶链式反应(PCR)相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用。该技术通过利用重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物，启动寻找模板DNA上的同源序列；当同源序列定位后，则会引发链置换反应。引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，实现了在常温下两条引物对靶基因的几何级数扩增。同时，在RPA反应体系中，对引物碱基突变具有较强的耐受性，在引物个别碱基突变后，RPA反应依然可以顺利进行。免疫侧流层析技术(Lateralflowassay，LFA)是当将含有待测抗原(或抗体)的样品滴在加样区，待测样品中的抗原(或抗体)与结合垫中的胶体金标记的抗体(或抗原)结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的抗体(或抗原)结合，形成胶体金微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线(T线)上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线(C线)二抗结合。若将RPA和LFA技术相结合，既可以实现ASFV核酸的等温体外快速扩增，又可以实现检测结果的可视化，在无需特殊仪器设备下即可实现ASFV的分子生物学快速检测，为ASF的临床快速诊断提供了一种新的手段，对预防和控制ASF在我国的流行具有十分重要的意义。本专利技术通过利用重组酶聚合酶扩增-免疫侧流层析(RPA-LFA)技术实现ASFV核酸的快速、可视化检测。针对ASFV基因组中髙保守的特异性序列P72基因为扩增的靶基因序列，根据RPA引物的设计原则设计了3对RPA特异性引物，上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，通过对含有ASFVP72基因的重组质粒DNA进行RPA扩增试验，从中筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，建立了检测ASFV核酸的RPA检测方法。在此基础上，将胶体金标记的兔抗地高辛抗体铺在结合垫上，NC膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被猪抗兔IgG，配合加样垫和吸收垫组装LFA层析试纸条。将RPA扩增产物滴加于LFA试纸条上样垫上，建立了检测ASFV特异性核酸的RPA-LFA可视化检测方法。利用建立的检测方法分别对猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪流感病毒(SIV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)等多种病毒进行扩增，证实本专利技术所建立的ASFVRPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性，为基层单位普通实验室ASFV感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用重组酶聚合酶扩增-侧向层析技术(RPA-LFA)建立检测ASFV核酸的可视化快速检测方法。通过对其他病毒核酸样本的检测证实建立的ASFVRPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，其上游引物核苷酸序列为<210>2，其下游引物核苷酸序列为210(3)。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，其上游引物核苷酸序列为&lt;210&gt;2，其下游引物核苷酸序列为210(3)。2.根据权利要求1所述的快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，主要通过下列步骤制备：ASFVP72基因的合成及其重组质粒的构建：确定P72基因序列进行P72全长cDNA的体外合成，并克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pT-ASFV-P72，将pT-ASFV-P72质粒转化至感受态细胞DH5α，将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度；ASFVP72基因重组质粒拷贝数的确定：将pT-ASFV-P72质粒拷贝数稀释在1×108～100拷贝/μL之间，RPA引物的设计利用BioEdit分子生物学软件对若干个ASFV不同毒株的P72基因进行序列比对，筛选出高度保守的区域作为RPA引物设计的靶序列，根据RPA引物的设计原则，引物长度30～35bp，设计若干对特异性引物，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，扩增片段大小约为220bp，以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板进行RPA扩增，通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物的特异性、敏感性和产量来评价和筛选引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物；RPA反应体系的配制及操作程序配制RPA反应体系，包含RPA-F、RPA-R、RehydrationBuffer29.5μL、ddH2O、模板和醋酸镁，将模板DNA和MgAc之外的所有试剂预混后，加入含有冻干酶制剂的PCR反应管中，并充分混匀，将模板加入反应管中，并将MgAc加入反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋，置于35-45℃恒温水浴锅中进行RPA反应35-45min；RPA最佳引物的筛选：配制RPA反应体系，以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板，分别用所选出的若干对ASFVRPA引物进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行的琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，评价引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。3.根据权利要求2所述的快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，通过下列步骤制备：采用柠檬酸三钠还原法制备制备平均颗粒直径为40nm的胶体金溶液，将胶体金溶液加入试管中，向其中加入兔抗地高辛抗体IgG，恒温缓慢振荡25-35min，3-5℃、12500-13500r/min离心35-45min，弃去上清液，沉淀溶解于Tris-HCL缓冲溶液中，低温密封保存，得胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG。4.一种快速检测快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂，其特征在于，根据权利要求1或2所述的引物制备。5.一种快速检测快速检测非洲...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔军，孟庆玲，李杰，李静，郭晶，田路路，乔梦凡，孟丹，伍晔晖，李重阳，田振中，张星星，蔡扩军，张再超，赵春光，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65