遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法技术

本发明专利技术为遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR(二氢吡啶二羧酸还原酶)提高L‑赖氨酸产量的方法属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术应用基因工程方法，定点突变谷氨酸棒杆菌JL‑6中DHDPR编码基因dapB，改变DHDPR蛋白结构，从而调节其对不同氧化还原辅因子的亲和力，解除L‑赖氨酸合成过程中对NADP(H/

Genetic modification of lysine yield by DHDPR in Corynebacterium glutaminosus

【技术实现步骤摘要】
遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法
本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法。技术背景L-赖氨酸是人类和动物所必需的、自身不能合成的氨基酸，属于八大必需氨基酸之一。由于L-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中。工业上生产L-赖氨酸的方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。因此，选育具有自主知识产权的高L-赖氨酸合成、低副产物积累的生产菌株，开发具有自主知识产权的高纯度低色级的L-赖氨酸生产新技术、新工艺，对拓宽产品应用范围和利润空间，实现企业可持续发展具有重要意义。用于生产L-赖氨酸的微生物包括多种属，其中国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)及其亚种和大肠杆菌(Escherichiacoli)的改造型菌株。L-赖氨酸生物合成不同于L-谷氨酸合成，C.glutamicum生物合成途径中合成1molL-赖氨酸需要消耗4molNADPH，而形成1molL-谷氨酸只需要1molNADPH。因此，为了提高C.glutamicum生物合成途径中L-赖氨酸的积累，提高C.glutamicum代谢途径中NADPH量或降低L-赖氨酸合成途径中NADPH需求量是非常重要的策略。二氢吡啶二羧酸还原酶(Dihydrodipicolinatereductase,DHDPR)是细菌和高等植物生物合成二氨基庚二酸和L-赖氨酸过程中第二个关键酶，催化二氢吡啶二羧酸的NAD(P)H-依赖的还原性反应，生成六氢吡啶二羧酸。该酶在细胞壁形成中起到关键性作用。有活性的DHDPR一般以四分体的形式存在，单个亚基分子量大小约为30kDa，每个亚基由两个区域组成，即C-端底物(即二氢吡啶二羧酸)或抑制子结合域和N-端二核苷酸结合域(即辅因子结合域)，两个功能域由一个可变的环连接。N-端二核苷酸结合域由位于中心的7个平行β折叠和位于外围的4个α螺旋组成，辅因子结合位点位于β折叠的C-端边缘，而C-端底物或抑制子结合域由4个β折叠和2个α螺旋组成。DHDPR既以NADH又以NADPH作为辅助因子，不同细菌的DHDPR对不同辅因子的亲和力也不同，如E.coli更青睐NADH，而C.glutamicum中DHDPR主要以NADPH作为辅因子参与L-赖氨酸的合成。和其他已发现的生物体中的DHDPR一样，C.glutamicum中DHDPR由基因dapB编码，其酶活不受合成途径中终产物的调节作用，但受2,6-吡啶二羧酸(2,6-PDC)的抑制。前人研究结果表明，通过定点改变NADPH-依赖型酶可以转变其对不同辅因子的亲和力。因此，通过定点突变C.glutamicum中DHDPR编码基因，改变DHDPR对NADPH的亲和力，从而可以增加L-赖氨酸产量。本实验室通过传统诱变方法，筛选得到的一株产L-赖氨酸突变菌株谷氨酸棒杆菌JL-6(C.glutamicumJL-6)，该菌经摇瓶发酵产L-赖氨酸14.5g/L。然而，对该菌株L-赖氨酸发酵过程中胞内氧化还原辅因子测定时发现，胞内NADPH含量依旧不足，从而限制了L-赖氨酸的进一步增加。另外，该菌株中DHDPR编码基因dapB也为发生错义突变。基于研究室前期研究基础，本专利技术首先分析比较了不同微生物中DHDPR蛋白结构，找到了潜在的调节DHDPR结合不同辅因子的氨基酸残基：第11位Lys残基和第13位Arg残基。利用基因工程方法，定点突变DHDPR编码基因dapB，使DHDPR氨基酸序列的第11位Lys残基和第13位Arg残基突变成Ala残基，获得重组菌株JL-6dapBA31G,A32C(即Lys11Ala突变株，K11A)和JL-6dapBC37G,G38C(即Arg13Ala突变株，R13A)。这些重组菌株提高了DHDPR对NADH的亲和力而降低了对NADPH的亲和力，解除了C.glutamicumJL-6发酵生产L-赖氨酸过程中NADPH供应不足的缺点，提高了菌株积累L-赖氨酸的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：定点突变C.glutamicumJL-6L-赖氨酸合成途径关键酶DHDPR编码基因dapB，改变DHDPR蛋白结构中辅因子结合域的结构，获得具有不同辅因子亲和力的重组菌株JL-6dapBA31G,A32C和JL-6dapBC37G,G38C。这些重组菌株提高了DHDPR对NADH的亲和力而降低了对NADPH的亲和力，解除了C.glutamicumJL-6发酵生产L-赖氨酸过程中NADPH供应不足的缺点，提高了菌株积累L-赖氨酸的能力。该专利技术为成功改造L-赖氨酸合成途径中关键酶的蛋白质结构，改变其辅因子亲和力，解除合成过程中NADPH供应不足提供了一条崭新的思路。本专利技术的技术方案：以基因工程为手段，通过改变二氢吡啶二羧酸还原酶的氧化还原辅因子亲和力，缓解L-赖氨酸合成过程中NADP(H/+)供应不足，获得高产L-赖氨酸的重组菌株。(1)改变了二氢吡啶二羧酸还原酶的氧化还原辅因子亲和力，可高效积累L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其分类命名分别为C.glutamicumJL-6dapBA31G,A32C和C.glutamicumJL-6dapBC37G,G38C。(2)所述重组菌的构建方法，首先利用在线软件比较分析不同微生物来源的DHDPR，确定潜在的调节DHDPR结合不同辅因子的氨基酸残基：第11位Lys残基和第13位Arg残基；利用定点突变试剂盒分别突变DHDPR编码基因dapB，随后利用携带抗生素抗性与条件致死型标记sacB双标记的新型整合型载体pK18mobsacB，通过两次同源重组替换C.glutamicumJL-6中自身基因dapB，分别获得重组菌株C.glutamicumJL-6dapBA31G,A32C和C.glutamicumJL-6dapBC37G,G38C。①潜在的调节DHDPR结合不同辅因子的氨基酸残基的确定来源于E.coli和结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的DHDPR更青睐利用NADH作为辅因子，而来源于C.glutamicum和海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的DHDPR更青睐利用NADPH作为辅因子。为此通过采用在线软件Clustalw和ESPript3.0比较分析它们DHDPR结构中的共同点与不同点，从而找出潜在的调节DHDPR结合不同辅因子的氨基酸残基：第11位Lys残基和第13位Arg残基。最后，采用PyMOL软件分析不同突变体的DHDPR蛋白结构发现，分别将第11位Lys残基和第13位Arg残基突变成Ala，会改变DHDPR中与NADPH的2’-磷酸残基的结构，从而影响DHDPR与NADPH的亲和性。因此，选择DHDPR氨基酸序列中第11位Lys残基和第13位Arg残基作为后期实验改造位点。②C.glutamic本文档来自技高网...

【技术保护点】
遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法，其特征在于，以基因工程为手段，通过改变DHDPR(二氢吡啶二羧酸还原酶，编码基因dapB)的氧化还原辅因子亲和力，高效积累L‑赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum JL‑6 dapB

【技术特征摘要】
1.遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法，其特征在于，以基因工程为手段，通过改变DHDPR(二氢吡啶二羧酸还原酶，编码基因dapB)的氧化还原辅因子亲和力，高效积累L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumJL-6dapBA31G,A32C和C.glutamicumJL-6dapBC37G,G38C。2.根据权利要求1所述的遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述基因工程菌C.glutamicumJL-6dapBA31G,A32C和C.glutamicumJL-6dapBC37G,G38C的构建思路，是利用一株产L-赖氨酸突变菌株C.glutamicumJL-6，定点突变DHDPR编码基因dapB，获得基因工程菌C.glutamicumJL-6dapBA31G,A32C和C.glutamicumJL-6dapBC37G,G38C，这两株工程菌提高了DHDPR对NADH的亲和力而降低了对NADPH的亲和力，解除了C.glutamicumJL-6发酵生产L-赖氨酸过程中NADPH供应不足的缺点，提高了菌株积累L-赖氨酸的能力。3.根据权利要求2所述的遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述定点突变DHDPR编码基因dapB的思路，是分别将验证正确的重组线性质粒pK18mobsacB/dapBA31G,A32C和pK18mobsacB/dapBC37G,G38C电击转化C.glutamicumJL-6，经含有25μgmL-1卡那霉素的LBHIS固体培养基筛选，获得第一次同源重组转化子，再分别将目标转化子在含100gL-1蔗糖的LBG固体培养基中进行胁迫二次重组筛选，最终在LBG平板上进行划线分离并挑取多个转化子，实现C.glutamicumJL-6中dapB基因序列中第31位和32位碱基分别由A突变成G和C以及序列中第37位和38位碱基分别由C和G突变成G和C。4.根据权利要求3所述的遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述重组线性质粒pK18mobsacB/dapBA31G,A32C和pK18mobsacB/dapBC37G,G38C的构建思路，其特征是利用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别酶切重组质粒Pucm-T/dapBA31G,A32C、Pucm-T/dapBC37G,G38C和线性化整合型载体pK18mobsacB，然后以酶连的形式将酶切片段dapBA31G,A32C与酶切的pK18mobsacB和酶切片段dapBC37G,G38C与酶切的pK18mobsacB，构建重组质粒pK18mobsacB/dapBA31G,A32C和pK18mobsacB/dapBC37G,G38C。5.根据权利要求4所述的遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述重组质粒Pucm-T/dapBA31G,A32C和Pucm-T/dapBC37G,G38C的构建思路，以Pucm-T/dapB为模板，分别以突变引物MCB1-F/MCB1-R和MCB2-F/MCB2-R为引物进行PCR反应，用DNA片段纯化试剂盒纯化后用限制性内切酶DpnI酶切，随后将酶切产物纯化后转化到E.coliJM106感受态细胞中，并涂布于氨苄抗性平板中筛选突变菌株，最后挑起在氨苄抗性平板生长良好的菌株培养，提取质粒并测序鉴定，获得重组质粒Pucm-T/dapBA31G,A32C和Pucm-T/dapBC37G,G38C；MCB1-F：5’-CGTTCTCGGAGCCGCAGGCCGTGTTGGTCAAAC-3’MCB1-R：5’-GTTTGACCAACACGGCCTGCGGCTCCGAGAACG-3’MCB2-F：5’-CGGAGCCAAAGGCGCTGTTGGTCAAACTATTGTG-3’MCB2-R：5’-CACAATAGTTTGACCAACAGCGCCTTTGGCTCCG-3’；PCR反应体系(50μL)：ExTaq酶25μL，Pucm-T/dapB100μg，正向引物(20μmol·L-1)1μL，反向引物(20μmol·L-1)1μL，加ddH2O至50μL；PCR反应条件：首先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸220s，计35个循环，最后72℃再延伸10min并4℃保存。6.根据权利要求5所述的遗传改造谷氨酸棒杆菌中DHDPR提高赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述中重组质粒Pu...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建中，张伟国，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32