用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法。所述宿主细胞包含以下核酸组合：EmoA和EmoB；或者包含EmoA、EmoB和ACC1；或者包含EmoA、EmoB和ACC1S1157A。用于合成山扁豆酸的方法包括以下步骤：构建及培养宿主细胞，并诱导工程改造的宿主细胞进行上述任意一组核酸组合的表达；对山扁豆酸进行收集和分离纯化。本发明专利技术用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法，可实现低成本高效率获取山扁豆酸。

Host cells and methods for the engineering transformation of the synthesis of mountain lentil acid

The invention relates to the biological engineering technology field, in particular to a host cell and method for the engineering transformation of the synthesis of mountain lentil acid. The host cells contain the following nucleic acid combinations: EmoA and EmoB; or contain EmoA, EmoB and ACC1; or include EmoA, EmoB, and ACC1S1157A. The methods for the synthesis of lentilic acid include the following steps: constructing and culturing the host cells, and inducing the engineered host cells to carry out the above expression of any group of nucleic acid combinations; collecting and separating the lentilic acid. The invention is used for the engineering transformation of the host cells and methods for the synthesis of mountain lentisic acid, which can achieve low cost and high efficiency to obtain the lentil acid.

【技术实现步骤摘要】
用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法。更具体的，本专利技术涉及工程改造的宿主细胞和用于使用所述工程改造的宿主细胞微生物生物合成山扁豆酸的方法。
技术介绍
山扁豆酸（Endocrocin），又叫内黄素、内红花素或内向藏花素，主要存在于一些特殊的地衣和真菌中，是一类蒽醌类天然化合物，被认为是生物合成大黄素等活性化合物的重要原料，能够应用于有机合成试剂、染料中间体制备等。山扁豆酸在一些科研中已经被证实对于一些特殊细胞类型具有毒性作用，像是小鼠黑素瘤细胞等，但对于人角化细胞等无影响，因此具有重要的潜在医用价值。经现代化学技术研究分析，山扁豆酸还是中药材大黄的主要有效成分之一，在调理便秘、胃肠道消化不良和其他疾病方面有良好效果。但目前缺少有效获取山扁豆酸的方法，从地衣、真菌或是植物中提取不仅无法获取有效的量，而且容易造成环境的不可修复性破坏。目前也没有任何有效的化学合成方式来获取这种重要的化学物质。而在生物合成方面，山扁豆酸产量等前景仍不具备市场化应用前景。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞，实现低成本高效率获取山扁豆酸。本专利技术的另一目的在于提供一种使用工程改造的宿主细胞微生物生物合成山扁豆酸的方法，该方法成本低，工艺简单且生产效率高。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞，所述宿主细胞包含以下核酸组合：EmoA和EmoB；或者包含EmoA、EmoB和ACC1；或者包含EmoA、EmoB和ACC1S1157A。其中，EmoA(EmoA)是一类能够用于合成蒽醌类化合物，特别是山扁豆酸的非还原性核酮糖聚合酶及其序列。其中，EmoB(EmoB)是一种硫酯酶，特别是能够用于蒽醌类化合物合成的金属-β-内酰胺酶类型的硫酯酶及其序列。其中，ACC1(ACC1)/ACC1S1157A(ACC1S1157A)——指一种乙酰辅酶A羧化酶（S1157A指定点突变1157位基因使编码由丝氨酸变为丙氨酸）；。山扁豆酸分子式如下：优选地，所述宿主细胞为细菌细胞或酵母细胞。优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌。优选地，所述酵母细胞为酿酒酵母或毕赤酵母。本专利技术的另一目的通过下述技术方案实现：一种宿主细胞合成山扁豆酸的方法，包括以下步骤：（1）构建及培养宿主细胞，其中所述宿主细胞用EmoA和EmoB；或者用EmoA、EmoB和ACC1；或者用EmoA、EmoB和ACC1S1157A转化；诱导工程改造的宿主细胞进行上述任意一组核酸组合的表达；（2）对山扁豆酸进行收集和分离纯化。优选地，所述宿主细胞为酵母细胞，所述酵母细胞的培养方法包括以下步骤：A1.培养所构建的工程菌酵母，先在含有6.7g/L酵母氮源、20g/L葡萄糖的酵母SC缺陷培养基中培养，并添加省却成分氨基酸混合物；30℃，250rpm下培养直至OD600达到0.6；A2.转移至含有YPD培养基中，根据培养效果调整培养温度、振荡频率和培养时间；A3.通过A2步骤培养所得的工程菌酵母在SC培养基中培养，并滴加相应的缺少成分，30℃，250rpm，直至OD600达到1.0，添加入1%酵母提取物和2%蛋白胨，28℃，250rpm下持续发酵6~8天，得发酵液；A4.发酵液通过3500rpm离心4-6分钟,收集细胞体，细胞体采用有机物提取，并于离心所得上清液混合后蒸发浓缩，随后进行分析。优选地，所述添加省却成分氨基酸混合物的步骤具体为：含有1个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.77g/L-UraDOsupplement；含有2个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.72g/L-Trp/-UraDOsupplement；含有3个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.62g/L-Trp/-Ura/-LeuDOsupplementt。本专利技术所述的宿主细胞可应用于生产山扁豆酸。本专利技术还提供一种用于扩增EmoA的PCR引物，所述EmoA扩增的正向引物基因序列如SEQIDNo.1所示，EmoA的反向引物基因序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供一种用于扩增EmoB的PCR引物，所述EmoB扩增的正向引物基因序列如SEQIDNo.3所示，EmoB的反向引物基因序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过对地衣和真菌合成山扁豆酸的代谢途径深入分析解剖，确认其合成的核心序列及功能酶，并在自然微生物资源中发掘出具有相同甚至更优秀效果的酶，进一步鉴定出其特有的基因序列特征，通过组合并利用宿主细胞表达的方式，实现低成本高效率获取山扁豆酸。附图说明利用附图对专利技术作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本专利技术的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。图1为本专利技术五种核酸组合的载体图谱，其中A为在指定载体的的限制性位点之间插入EmoA基因序列，限制性位点可以选择为NdeI和AscI，B为在指定载体的的限制性位点之间插入ACC1或ACC1SS1157A基因序列，限制性位点可以选择为NdeI和PmeI，C为在指定载体的的限制性位点之间插入EmoB基因序列，限制性位点可以选择为NdeI和PmeI。图2为山扁豆酸的液相分析鉴定图，其中线框内部分为山扁豆酸。可以看到，通过本专利技术的基因信息并通过组合优化，可以有效提高山扁豆酸的产量。图3为山扁豆酸紫外图谱。图4为山扁豆酸质谱图。图5为向工程菌中添加ACC1或ACC1S1157A基因序列对山扁豆酸产量的提升产生显著增加效果，以仅含有EmoA和EmoB基因的工程菌产量为对照（221.3mg/L），增加ACC1基因的工程菌可以提高产量至316.3mg/L，而将ACC1更换为ACC1S1157A，产量则进一步提升至669.3mg/L。图6表示实施例2中步骤2.3向培养基中添加不同成分对提高山扁豆酸产量的影响。以基础培养基为对照，工程菌的产量（196.1mg/L）在添加果糖或丙三醇后并没有发生显著变化（分别为193.5mg/L和189.2mg/L），而在添加丙酮酸后，产量提升至223.4mg/L。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，见附图1-6。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。实施例1构建工程改造的宿主细胞1.1设计特定引物序列获取相应的基因片段，EmoA及EmoB的概述引物序列如表1所示。ACC1(GenBankaccessionnumberCAA96294.1)上述基因信息可通过查询获取并设定引物实现。其中引物可以根据基因序列信息自行设计，并不局限于此处说明的引物。EmoA的相似序列同样具有本专利技术合成山扁豆酸的相关功能，并不局限于本专利技术所公开的序列。表1中各引物基因序列的下划线部分为限制性位点。通过常用的生物技术手段构建表达山扁豆酸的途径，通过PCR将上述的基因组序列进行扩增，构建如图A-C的载体，并转化至选用的酵母菌株中。本实施例中，EmoB与原生合成山扁豆酸的基因序列同源性为88%.实施例2培养宿主细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含以下核酸组合：EmoA和EmoB；或者包含EmoA、EmoB和ACC1；或者包含EmoA、EmoB和ACC1S1157A。

【技术特征摘要】
1.一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含以下核酸组合：EmoA和EmoB；或者包含EmoA、EmoB和ACC1；或者包含EmoA、EmoB和ACC1S1157A。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌细胞或酵母细胞。3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于：所述细菌细胞为大肠杆菌。4.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于：所述酵母细胞为酿酒酵母或毕赤酵母。5.一种利用权利要求1-4任一所述的宿主细胞合成山扁豆酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）构建及培养宿主细胞，其中所述宿主细胞用EmoA和EmoB；或者用EmoA、EmoB和ACC1；或者用EmoA、EmoB和ACC1S1157A转化，并诱导所述工程改造的宿主细胞进行上述任意一组核酸组合的表达；（2）对山扁豆酸进行收集和分离纯化。6.根据权利要求5所述的合成山扁豆酸的方法，其特征在于：所述宿主细胞为酵母细胞，所述酵母细胞的培养方法包括以下步骤：A1.培养所构建的工程菌酵母，先在含有6.7g/L酵母氮源、20g/L葡萄糖的酵母SC缺陷培养基中培养，并添加省却成分氨基酸混合物；30℃，250rpm下培养直至OD600达到0.6；A2.转移至含有YPD培养基中，根据培养效果调整培养温度、振荡频率和...

【专利技术属性】
技术研发人员：占纪勋，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33