一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法技术

本发明专利技术一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，涉及细菌，该菌株是肠膜明串珠菌

A mutant strain of a strain of mannitol with high mannitol and its application

A mutant strain of a mutant strain of the intestinal membrane of mannitol with high mannitol and its application method, relating to bacteria, is a strain of M. enteribeenis

【技术实现步骤摘要】
一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
本专利技术的技术方案涉及细菌，具体地说是一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法。
技术介绍
甘露醇(Mannitol)是一种己六醇，在医药领域、食品领域和塑料领域均得到广泛的应用。目前，世界上工业生产甘露醇主要有二种工艺。第一种是海藻提取法：提取1吨甘露醇约需13～15吨干海带，在生产海藻酸盐的同时，将提碘后的海带浸泡液，经多次提取浓缩、除去杂质、离子交换、蒸发浓缩、冷却结晶而得；生产过程产生大量废水，能耗高，污染严重，收率低。第二种是催化加氢法：以蔗糖或葡萄糖为原料，通过水解、差向异构与酶异构，然后加氢而得；原料来源稳定，生产期限不受限制，成本低，但是其产率较低，且有山梨醇伴生。实验室生产甘露醇的方法还有二种。一是酶转化法，酶法氢化须要在体系中加入价格昂贵的辅酶，不经济。二是微生物发酵法，自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，细菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。在乳酸细菌转化甘露醇的过程中，甘露醇为主要产物，同时产乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不产生其它多元醇等副产物，因而易于纯化分离及精制，并且条件温和、转化率较高。很多菌株以果糖为底物发酵产生甘露醇，而明串珠菌将果糖和蔗糖都可以作为底物产生甘露醇。廉价的蔗糖进入明串珠菌胞内后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再转化为甘露醇，反应步骤相对少；而同型乳酸发酵的乳杆菌中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖和1-磷酸甘露醇等中间产物最终转化为甘露醇，反应步骤相对多；明串珠菌的染色体基因组只有2M左右，故发酵周期只有20小时左右；明串珠菌是耐氧的，故发酵过程中不需要提供氧气；因此明串珠菌实现大规模工业化生产甘露醇的潜力比较大。CN201710051539.3公开了一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，该明串珠菌突变菌株是葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，虽然比原始菌株提高了产量，但还是比较低，不足以应用于生产中。总之，现有的明串珠菌发酵技术中，以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高，还需进一步提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，该肠膜明串珠菌突变菌株是以现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体––肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)为出发菌，采用分子生物学技术敲除丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因、果糖激酶编码基因和乙酰磷酸转移酶编码基因并敲入甘露醇脱氢酶编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是CCTCCNo：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。本专利技术解决该技术问题所采用的技术方案是：一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCCNo：M2017578，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCCNo：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量百分比1％转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.73克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97.3％。上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所述MRS培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO42克、MnSO4·H2O0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到MRS培养基。上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所涉及的原料、试剂和仪器均由商购获得，所涉及的操作工艺是本领域技术人员能够掌握的。本专利技术的有益效果是：与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的实质性特点和显著进步：(1)本专利技术采用分子生物学技术敲除现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体––肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1lΔD-ldh)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因、果糖激酶编码基因和乙酰磷酸转移酶编码基因并敲入甘露醇脱氢酶编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是CCTCCNo：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat--mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。(2)将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCCM2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量百分比1％转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，检测代谢产物，通过对比试验证明，该明串本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，其特征在于：是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D‑乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌

【技术特征摘要】
1.一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，其特征在于：是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdts1∆D-ldh∆stpk-mdh∆fk-mdh∆pat-mdh（LeuconostocmesenteroidesΔdts1∆D-ldh∆stpk-mdh∆fk-mdh∆pat-mdh）菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCCNo：M2017578。2.权利要求1所述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，其特征在于：在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保...

【专利技术属性】
技术研发人员：金红星，卢哲，成文玉，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：天津,12