增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法技术
High production of annshycin and its preparation methods for enhancing the transcriptional level of polyketone synthase gene
A high producing amtinomycin strain with enhanced transcriptional level of polyketide synthase gene and its preparation method, belonging to the field of biomedicine technology, improves the production of amtinomycin by improving the expression level of speed limiting enzyme gene in biosynthetic pathway. Through the use of the erythromycin resistance gene promoter to enhance the expression level of PKS gene ansa9 and enhance the ability of amtinomycin biosynthesis, we can enhance the production of amtinomycin in the rare bundle ansa9 actinomycete. ANSI fermentation engineering strain obtained by the invention of the final yield is about 125% higher than the original strain, the laboratory flask reached a level of 99 mg/L.
【技术实现步骤摘要】
增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法
本专利技术涉及的是生物医药领域，具体说是一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法，主要通过在珍贵束丝放线菌ATCC31280中，利用红霉素抗性基因启动子增强PKS基因ansa9的表达水平，从而增强安丝菌素的生物合成能力，进而提高安丝菌素产量。
技术介绍
安丝菌素是微生物来源的美登素类分子，属于I型聚酮化合物，由珍贵束丝放线菌（Actinosynnemapretiosum）产生，具有很强的抗肿瘤活性，在其多个组分中，安丝菌素P-3活性最强。目前，安丝菌素的多种抗体偶联分子已经进入不同的临床实验阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的trastuzumabemtansine（即T-DM1）已经成药上市。鉴于其重要的医用价值，安丝菌素产量的提高受到了广泛研究。通过文献调研，我们发现聚酮酶（PKS）的活性会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类化合物的最终产量，而通过对生物合成途径中的限速酶表达基因进行过量表达是提高抗生素产量的一种常用策略。由前期转录数据分析我们发现，AP-3生物合成基因簇中的PKS基因ansa9转录水平很低，可能为AP-3生物合成瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株、该菌株其制备方法以及利用该菌株生产安丝菌素的方法。该突变菌株基于珍贵束丝放线菌（ATCC31280）基因组中的安丝菌素生物合成PKS基因ansa9上游插入组成型强启动子-红霉素抗性基因启动子，使安丝菌素生物合成途径中的限速步骤基因加倍，增强聚酮合酶的表达水平...
【技术保护点】
一种增强聚酮合酶基因转录水平的安丝菌素菌株，其特征在于：基因ansa9起始密码子前插入红霉素抗性基因启动子。
【技术特征摘要】
1.一种增强聚酮合酶基因转录水平的安丝菌素菌株，其特征在于：基因ansa9起始密码子前插入红霉素抗性基因启动子。2.根据权利要求1所述增强聚酮合酶基因转录水平的安丝菌素菌株，其特征在于：出发菌株为ATCC31280。3.一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1），设计并扩增用于同源重组的同源左臂右臂，以及用于加强基因表达的组成型强启动子permE*；步骤2），设计并构建用于通过同源重组在ansa9起始密码子前插入红霉素抗性基因启动子的质粒；步骤3），将上述构建得到的质粒通过接合转移导入受体菌珍贵束丝放线菌ATCC31280中进行同源重组；步骤4），通过抗性筛选和PCR验证获得过量表达ansa9基因的突变株。4.根据权利要求3所述的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于：所述质粒由pJTU1278的SacI/HindIII位点插入左右同源臂，并利用XbaI/BglII酶切位点插入启动子序列。5.根据权利要求3或4所述的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于：所述启动子为红霉素抗性基因启动子。6.根据权利要求5所述的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于，启动子的序列为：GCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGTATGCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTAGGATCCACATATGTTGGGGA。7.根据权利要求6所述的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于，用于通过同源重组插入启动子的同源臂左臂序列为：GCGGACAGCAGCAGCGGCAGCGCGCCCGCCGGACGCCGCTCCCCCGGCCCGGTCGGCGCGTCGCCCTCCTCCACGACCAGGTGCGCGTTGGTCCCGCTCATGCCGAACGCGGACACCGCCGCGCGCCGGGACCGCTCCCCGCGCGGCCACGGCGCGGGCTCGGTCAGCACCCGCAGCGCGCCGGAGCCCCAGTCGACCTCGGGGGTGAGCCGGTCGGCGTGCAGGGTGCGCGGCGCCACGCCGTGGCGCAGCGCCTGCACGACCTTGACCAGCCCCAGCACCCCGGCCGCGCCCTGGGCGTGCCCGATGTTGGACTTGAGCGAGCCGAGCAGCAGCGGCCTGCCCCCTGGCCTGGCGCGCCCGTAGGTGGCCTGGAGCGCCGCCGCCTCGATCGGGTCGCCGAGGCGGGTGCCGGTGCCGTGCGCCTCCAGCAGGTCCACGTCGGACGGCCGCAGCCCCGCGTCCTCCAGCGCCGCCTCGATGACGCGCTGCTGCGCGGCCCCGTTCGGCGCGGTCAGCCCGTTGGACGCGCCGTCGGAGTTGACCGCGCTGCCCCGGACCACCGCCAGCACCGGCCGCCCGGCGCGGCGCGCGTCCGAGAGCCGCTCCAGCAGCACCACGCCGACGCCCTCGCCCCACGCCGTGCCGTCGGCGTCGGCGGAGAACGCCTTGCAGCGGCCGTCCGGGGACAGTCCGCGCTGCCGGGCGAACTCGACGAACACGTCCGACAGGGGCATGACCGTCGCGCCGCCCGCCAGCGCCATCGCGCACTCGCCGCGCCGCAGCGACTGCGCGGCCAGGTGGATCGCGACCAGCGACGACGAGCAGGCGGTGTCCACGGTGAGCGCGGGCCCGTGCAGGCCGAGCGCGTAGGCGACCCGGCCGGAGGCGACGCTGCCGGAGCTGCCGATGGCCAGGTGGCCCTCGAACTCCTCGGCGACGCGCCGCCGGTTGCCGTAGTTCTGGTAGACCACGCCGGAGAAGACGCCGGTGCCGGTGCCGCGCAGCGACAGCGGGTCGATGCCCGCGCGCTCGACCGCCTCCCAGGAGGTCTCCAGGAGCATCCGGTGCTGCGGGTCGATCGTGACGGCCTCGCGCGGGCCGATGCCGAAGAACCCGGCGTCGAACTCGGCGGCGTCGTGCAGGAACCCGCCCTCGCGGGTGTAGCAGGTGCCCGGCCGGGTCGGGTCGGGGTCGTAGAGCCCGGCCAGGTCCCAGCCGCGGTCGGTGGGGAACCCGGTGATCGCGTCGACGCCGCCGTCCACCAGTTCCCACAGCGCTTCCG...
【专利技术属性】
技术研发人员：于丽洁，白林泉，宁新娟，郭舒扬，
申请(专利权)人：辽宁斯韦尔生物科技有限公司，上海交通大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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