中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法技术

一种中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法，属于生物医药技术领域，基于失活安丝菌素N位糖基转移酶表达基因来提高安丝菌素发酵水平，通过在珍贵束丝放线菌ATCC31280中失活N位糖基转移酶基因ansa30（与珍贵束丝放线菌ATCC31565中的asm25基因具有97%同源性），减少该途径对安丝菌素生物合成的分流，实现安丝菌素产量的提高。本发明专利技术所得到的突变株NXJ‑22安丝菌素的发酵终产量对比野生型菌株则提高68%，实验室摇瓶水平达到74mg/L。

Isolation and deletion of high-yielding actinomycin and its preparation methods

A missing high ansamitocin strain and a preparation method thereof, belonging to the technical field of biological medicine, inactivation of ansamitocin N glycosyltransferase gene expression based on improved ansamitocin fermentation level by actinomycetes ATCC31280 in the precious bundle silk inactivating N glycosyltransferase ansa30 gene (asm25 gene and precious bundle on actinomycetes in ATCC31565 has 97% homology), the way of reducing ansamitocin biosynthesis shunt, achieve ansamitocin yield increase. The mutant NXJ fermentation 22 ansamitocin final yield increased by 68% compared to the wild type strain, flask level reached 74mg/L.

【技术实现步骤摘要】
中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体说是一种高产安丝菌素的菌株以及该菌株的制备方法，该方法主要是通过敲除珍贵束丝放线菌ATCC31280基因组中N位糖基转移酶的表达基因ansa30，以消除N位糖基化对N位甲基化途径的竞争作用，使氨甲酰化安丝菌素糖苷ACGP-3积累消失，而代谢流更多的流向目标产物，从而提高了安丝菌素的产量。
技术介绍
安丝菌素(又名安丝霉素或安莎霉素)是由珍贵束丝放线菌（Actinosynnemapretiosum）产生的一种大环内酰胺类抗生素，属于微生物来源的美登素类分子，其组分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4和P-4'，其中安丝菌素P-3（AP-3，1）为主要发酵产物，安丝菌素能够与微管蛋白的β亚基结合，通过阻碍微管形成，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著的抗肿瘤作用。例如，ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C-3位酯链上连接二硫键形成的DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体结合分子。目前，安丝菌素多种DM1抗体结合分子已经进入不同的临床实验阶段。其中，由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的TrastuzumabEmtansine（即T-DM1）已经成药上市。现有技术中，其中一种安丝菌素生物合成的方法主要包括起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）的合成（葡萄糖为前体），随后在I型聚酮合酶（PKSI）催化作用下，加载7个延伸单元-3个乙酸单元（丙二酰CoA提供），3个丙酸单元（甲基丙二酰CoA提供），1个糖基（Glycolate）延伸单元（2-羟甲基-ACP提供，来源于糖酵解途径），形成十九元大环内酰氨，最后经过一系列的后修饰过程，包括：氯代、氧甲基化、氨甲酰化、酰化、环氧化、N-甲基化（SAM依赖）形成安丝菌素。但是，其中由糖基转移酶ansa30催化的N-糖基化反应为N-甲基化反应的竞争途径，导致ATCC31280液体发酵液中，分支产物-氨甲酰化安丝菌素糖苷ACGP-3（4＂-O-carbamoyl-ansamitocinosideP-3）积累。副产物的形成影响了目标产物的产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高产安丝菌素的菌株、该突变株的制备方法以及通过该突变株高产安丝菌素的方法。该突变株基于中断N-甲基转移酶表达基因ansa30的表达，以消除代谢途径中N糖基化对N甲基化的竞争，将代谢流更多地导向目标产物的合成，从而提高安丝菌素的产量。为此，本专利技术提供了如下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种中断缺失的高产安丝菌素的菌株，其技术要点是：所述菌株的N位糖基转移酶基因ansa30不表达。进一步的，突变株（NXJ-22）由菌株ATCC31280制备得到。另一方面，本专利技术还提供了该中断缺失的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：步骤1）构建用于ansa30中断缺失的同源重组质粒载体；步骤2）将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌中进行同源重组；步骤3）通过验证硫链丝菌素抗性或PCR产物片段大小的差异的方法筛选ansa30基因中断缺失的突变株。进一步的，质粒载体由质粒pJTU1278制备。进一步的，受体菌为ATCC31280。进一步的，步骤1）中，由两组引物通过PCR扩增得到ansa30中断区域左侧及右侧的同源臂。进一步的，步骤1）中，在质粒SpeI/HindIII位点插入中断区域左侧1440bp的PCR片段(SpeI/EcoRI)，在中断区域右侧1465bp的PCR片段(EcoRI/HindIII)。左同源臂的序列为：CCGACGACTGACCCGCCACCGGGGACGGGGGCCGACCGGAATCCCGGTCGGCCCCCGTCCGCGTTCCAGGGGGGGGCGAGTCACGCGGGTTCAGGACCGGGCCGCGCGCACCCCGTCCCGCACCGCCCCCGTCACCCGGTGCGCCCCGCTCACCAGCGAGGTCACCAGCTCCCCCGGCCTGGGCGCCCGAGCCAGCAGCGCCGTCACCGGGCTGGACTCCAGCACCCGCCCCGGATACGCCCCGTGCACCCGCCCGTCCTCGTCCACCGGCGAGTCCACGTTGTCCACGCCGTTGTCCGGCAGCTCCGACCGCATCCCCGACCGGCCGACCGCGCGCACCGACATCAGCGCGTCCGTGAGCGCCGGGAACAGCCGCTGCCCCAGGTAGAACGCGAGCGCCGCGTCACCCACCGGCACCTCGCGGCGGGGGCGTTCGGCGGCGCGCAGCACGGCCTCAGCGACCAGCTCCGGCGCGTACACCGGAGGCGGCGGCTCGGGCAGCGAGCCGACGCGGCTGCGGCAGTGCTCGAAGAACGGGCTGTTGATCGCGGCGGGCAGCACGGCGGTGACCGCGATCGGCTCGCCGTCGTGGGCCAGCTCCACCCGCAGCGCGTCGTAGAACGCCCGCACCGCCGCCTTGCTGGCCGCGTACGGGGCCTGGAGCGGCGCCGAGCGCAGCCCGAGCACGGACGCGACCCCGATCAGCACTCCTCCGCCCGCCCGGCGCAGCGCGGGCAGCGCGGCCTTGGCCCCGTGCACGTGCCCGAGGTAGTTGACCCGCATCACCCGGTCGAACTCCTCGGCGGGGGTGTCCTCCACCCGCCCGTACACGCCGATCCCGGCCGCGTTCACCCAGGTGTCCACCCGCCCGAACCGCTCCACCGCCACCTCGGCGACCGCGCGCACCGCGGCCTCGTCGGCGATGTCCGCCGTCACCGCGACCGCAGGCCCACCCGCGTCCCGGACCTCCTCGACCAGCCCGTCGAGCGCGCGGGTGTTGCGCGCCGCGCACACCACGCGCGCCCCCGCCGCCGCGAACCGCAGCGCGGTGACCCGCCCGATCCCCGACGACGCGCCCACCACGACGACGACCTGCTCCGCCAACCTCCTGGGCATGTGACCTCTCCGTCCCGGATCGTGAAATGCGGCGGGTACCCGGCGGGAGGCCGTCCACGCGTCCCGGAGGGATGGTCCGCGCGGACGGCGGGTGGTCCGGATCGGAGGCGGGCCCTCGACCCCGGCAGTCCGATCAGCGCACGACCGACCAGGGCGCGGCCGTCCAGCGCACGACCATCCAGCACGCGACCGACCAGGGCGCGACCGACCAGCACGCGGCCGTCCGCCCCGGACCCGGACACCCGGCACCCCGCACGGCCCGCGCGGTCACACCGCCGCGACGCTCCGCGCGGCCTCCGCGATCTGCTCCAGGCGGGTCACCAC；或者/和右同源臂的序列为：GACGGTCAGGCAGGGCAGCCCGCGCTCCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中断缺失的高产安丝菌素菌株，其特征在于：所述菌株的N位糖基转移酶基因ansa30不表达。

【技术特征摘要】
1.一种中断缺失的高产安丝菌素菌株，其特征在于：所述菌株的N位糖基转移酶基因ansa30不表达。2.根据权利要求1所述的中断缺失的高产安丝菌素菌株，其特征在于：出发菌株为ATCC31280。3.一种中断缺失的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1）构建用于ansa30中断缺失的同源重组质粒载体；步骤2）将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌中进行同源重组；步骤3）通过验证硫链丝菌素抗性或PCR产物片段大小的差异的方法筛选ansa30基因中断缺失的突变株。4.根据权利要求3所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：质粒载体由质粒pJTU1278制备。5.根据权利要求3或4所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：受体菌为ATCC31280。6.根据权利要求5所述的高丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：步骤1）中，由两组引物通过PCR扩增得到ansa30中断区域左侧及右侧的同源臂。7.根据权利要求6所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：步骤1）中，在质粒SpeI/HindIII位点插入中断区域左侧1440bp的PCR片段(SpeI/EcoRI)，在中断区域右侧1465bp的PCR片段(EcoRI/HindIII)。8.根据权利要求7所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于，左同源臂的序列为：CCGACGACTGACCCGCCACCGGGGACGGGGGCCGACCGGAATCCCGGTCGGCCCCCGTCCGCGTTCCAGGGGGGGGCGAGTCACGCGGGTTCAGGACCGGGCCGCGCGCACCCCGTCCCGCACCGCCCCCGTCACCCGGTGCGCCCCGCTCACCAGCGAGGTCACCAGCTCCCCCGGCCTGGGCGCCCGAGCCAGCAGCGCCGTCACCGGGCTGGACTCCAGCACCCGCCCCGGATACGCCCCGTGCACCCGCCCGTCCTCGTCCACCGGCGAGTCCACGTTGTCCACGCCGTTGTCCGGCAGCTCCGACCGCATCCCCGACCGGCCGACCGCGCGCACCGACATCAGCGCGTCCGTGAGCGCCGGGAACAGCCGCTGCCCCAGGTAGAACGCGAGCGCCGCGTCACCCACCGGCACCTCGCGGCGGGGGCGTTCGGCGGCGCGCAGCACGGCCTCAGCGACCAGCTCCGGCGCGTACACCGGAGGCGGCGGCTCGGGCAGCGAGCCGACGCGGCTGCGGCAGTGCTCGAAGAACGGGCTGTTGATCGCGGCGGGCAGCACGGCGGTGACCGCGATCGGCTCGCCGTCGTGGGCCAGCTCCACCCGCAGCGCGTCGTAGAACGCCCGCACCGCCGCCTTGCTGGCCGCGTACGGGGCCTGGAGCGGCGCCGAGCGCAGCCCGAGCACGGACGCGACCCCGATCAGCACTCCTCCGCCCGCCCGGCGCAGCGCGGGCAGCGCGGCCTTGGCCCCGTGCACGTGCCCGAGGTAGTTGACCCGCATCACCCGGTCGAACTCCTCGGCGGGGGTGTCCTCCACCCGCCCGTACACGCCGATCCCGGCCGCGTTCACCCAGGTGTCCACCCGCCCGAACCGCTCCACCGCCACCTCGGCGACCGCGCGCACCGCGGCCTCGTCGGCGATGTCCGCCGTCACCGCGACCGCAGGCCCACCCGCGTCCCGGACCTCCTCGACCAGCCCGTCGAGCGCGCGGGTGTTGCGCGCCGCGCACACCACGCGCGCCCCCGCCGCCGCGAACCGCAGCGCGGTGACCCGCCCGATCCCCGACGACGCGCCCACCACGACGACGACCTGCTCCGCCAACCTCCTGGGCATGTGACCTCTCCGTCCCGGATCGTGAAATGCGGCGGGTACCCGGCGGGAGGCCGTCCACGCGTCCCGGAGGGATGGTCCGCGCGGACGGCGGGTGGTCCGGATCGGAGGCGGGCCCTCGACCCCGGCAGTCCGATCAGCGCACGACCGACCAGGGCGCGGCCGTCCAGCGCACGACCATCCAGCACGCGACCGACCAGGGCGCGACCGACCAGCACGCGGCCGTCCGCCCCGGACCCGGAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：于丽洁，白林泉，宁新娟，郭舒扬，
申请(专利权)人：辽宁斯韦尔生物科技有限公司，上海交通大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21