增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法技术

一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法，属于生物医药技术领域，通过提高生物合成途径中的限速酶基因表达水平，进而提高安丝菌素产量。通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280的糖基转移酶表达基因中断缺失突变株NXJ‑22中，利用强启动子kasOp*过量表达后修饰基因asm10，增强甲基转移酶活性，从而提高安丝菌素产量。本发明专利技术所得的工程菌株的安丝菌素的发酵终产量较对照菌株提高约173%，实验室摇瓶水平达到141.8 mg/L。

High production of annshycin and its preparation methods for enhancing the transcription level

A high producing amtinomycin strain with enhanced transcriptional level and its preparation method, belonging to the field of biomedicine, can improve the production of amtinomycin by improving the expression level of speed limiting enzymes in biosynthetic pathway. The expression of gene disruption mutants of NXJ in 22 by glycon in the precious bundle of actinomycete ATCC 31280 transferase, overexpression of the strong promoter kasOp* gene modified asm10, enhanced methyltransferase activity, thereby improving the ansamitocin yield. ANSI fermentation engineering strain obtained by the invention of the final yield than the control strain increased by about 173%, flask level reached 141.8 mg/L.

【技术实现步骤摘要】
增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法
本专利技术涉及的是生物医药领域，具体说是一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法，主要是通过在珍贵束丝放线菌ATCC31280的糖基转移酶表达基因中断缺失突变株NXJ-22中，利用强启动子kasOp*过量表达后修饰基因asm10，增强安丝菌素甲基转移效率，提高安丝菌素生物合成能力，进而提高安丝菌素产量。
技术介绍
安丝菌素是由珍贵束丝放线菌（Actinosynnemapretiosum）产生的一种大环内酰胺类抗生素，它能够与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管组装，从而抑制肿瘤细胞分裂。来自ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C-3位酯链上连接二硫键形成的DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体结合分子。目前，安丝菌素多种DM1抗体结合分子已经进入不同的临床实验阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的TrastuzumabEmtansine（即T-DM1）已经成药上市。除了抗肿瘤活性外，安丝菌素还能抑制真核生物，如真菌，酵母，昆虫等。安丝菌素生物合成主要包括三部分：起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）的合成，聚酮链的延伸（I型聚酮合酶催化）和复杂的后修饰途径，包括：氯代、氧甲基化、氨甲酰化、酰化、环氧化、N-甲基化（SAM依赖）或者糖基化形成安丝菌素，其中由糖基转移酶Asm25催化的N-糖基化反应为N-甲基化反应的竞争途径，生成分支产物-糖基化安丝菌素。虽然可通过糖基转移酶表达基因进行中断缺失，得到的突变株NXJ-22，使N位糖基化对N位甲基化途径的竞争被消除，但是，N位甲基化效率仍旧较低。通过现有技术公开的内容可知，后修饰途径的效率对于终产物的产量和活性都有着至关重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高产安丝菌素的菌株、该突变株的制备方法以及通过该突变株高产安丝菌素的方法。该突变株基于过量表达N位甲基转移酶表达基因asm10，通过加倍安丝菌素生物合成途径中的限速步骤基因，增强甲基转移酶基因表达水平，从而提高安丝菌素的产量。为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株，其技术要点是：所述菌株的N位甲基转移酶过量表达。进一步的，突变株由菌株ATCC31280过量表达后获得。另一方面，本专利技术提供了该增强转录水平的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：步骤1），构建用于加倍甲基转移酶基因asm10的整合型质粒载体；步骤2），将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌NXJ-22中进行同源重组，并筛选基因过量表达的突变株。进一步的，步骤1）中，质粒载体由质粒pDR3-K*重组获得。进一步的，基因asm10来源于珍贵束丝放线菌ATCC31565。进一步的，在起始密码子前插入RBS位点序列ATCTGAGTTGAAGAGGTGACGTC。进一步的，步骤3)中，通过抗性筛选和PCR验证获得过量表达asm10基因的突变株。进一步的，质粒载体的构建通过在质粒的SpeI/EcoRI位点插入asm10的PCR片段（SpeI/EcoRI）。此外，本专利技术还提供了一种采用上述突变株制备安丝菌素的方法，其技术要点是，包括以下步骤：将活化后的asm10基因过量表达突变株的菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220r/min条件下培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220r/min的转速下培养24h；按10%的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220r/min的转速下发酵7d后收集发酵液并进行萃取。进一步的，上述安丝菌素的制备方法中：一级种子培养基包括TSB3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖5w/v%；或者二级种子培养基包括TSB3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖2.5w/v%，异丁醇0.05v/v%，异丙醇0.05v/v%，淀粉1w/v%；或者发酵培养基包括酵母提取物0.8w/v%，麦芽提取物1w/v%，蔗糖1.5w/v%，异丁醇0.5v/v%，异丙醇1.2v/v%，淀粉2.5w/v%，MgCl22mmol/L。本专利技术的有益效果：现有技术中，通常选用的受体菌为A.pretiosumATCC31565，以asm10基因回补所用载体为pIB139，所用启动子为permE*，而本专利技术所用受体菌为ATCC31280衍生的突变株，asm10基因过量表达所用载体为pDR3-K*，所用启动子为kasOp*。通过上述方法，相较于现有技术asm10基因回补到突变株中时，AP-3产量恢复到与野生型相近水平；而通过本专利技术的方法在asm10基因过量表达后，AP-3产量对比对照菌株提高至少173%。综上所述，在珍贵束丝放线菌ATCC31280的糖基转移酶基因中断缺失突变株NXJ-22中，利用整合型载体pDR3-K*(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*强启动子），在NXJ-22染色体上插入一个拷贝的甲基转移酶表达基因asm10(来源于珍贵束丝放线菌ATCC31565），增强asm10的转录水平，较对照菌株（空白载体整合菌株）提高173%以上，最终产量达到141.8mg/L，通过本专利技术可显著提高安丝菌素的发酵产量。附图说明图1为asm10基因加倍质粒构建示意图；图2为asm10基因过表达突变株与对照菌株转录水平对比示意图；图3为asm10基因加倍突变株与对照菌株安丝菌素发酵产量示意图。具体实施方式以下实例将结合附图对本专利技术作进一步说明。虽然以下给出了本专利技术优化的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。实施例1本实施例为制备基因asm10过量表达的突变株的具体过程。具体包括以下步骤：步骤1），构建质粒pLQ586：以珍贵束丝放线菌ATCC31565基因组DNA作为模板，使用引物asm10-F/R，通过PCR扩增得到asm10片段（885bp），在序列两端引入SpeI/EcoRI酶切位点，并在起始密码子前插入RBS序列（ATCTGAGTTGAAGAGGTGACGTC）。在质粒pDR3-K*的SpeI/EcoRI位点插入asm10(SpeI/EcoRI))，得到质粒pLQ586。*本专利技术涉及的各内切酶识别位点（酶切位点）如下：步骤1)所用到的引物序列为：*步骤1）中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：PCR反应体系：DNA模板30ng，引物30pmol，50%DMSO3mL，25mMMg2+2mL，缓冲液3mL，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至30mL；PCR条件：95℃5min；95℃30s；60℃30s；68℃2min；循环30次；68℃10min。步骤2），将步骤1）构建得到的过量表达（基因加倍）的质粒载体pLQ586通过接合转移导入受体菌NXJ-22中进行同源重组，并通过PCR验证筛选正确的接合子，从而得到asm10基因加倍（过量表达）的突变株。具体包括以下步骤：将基因asm10过量表达的质粒pLQ586转化进入宿主ET12567（含有pUZ8002质粒）中。取ET12567于含有Apr、Kan和Chl三种抗生素的LB中，37°C过夜培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株，其特征在于：所述菌株的N位甲基转移酶过量表达。

【技术特征摘要】
1.一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株，其特征在于：所述菌株的N位甲基转移酶过量表达。2.根据权利要求1所述的增强转录水平的高产安丝菌素菌株，其特征在于：菌株由ATCC31280过量表达后获得。3.一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1），构建用于加倍甲基转移酶基因asm10的整合型质粒载体；步骤2），将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌NXJ-22中进行同源重组，并筛选基因过量表达重组的突变株。4.根据权利要求3所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：步骤1）中，质粒载体由质粒pDR3-K*重组获得。5.根据权利要求3或4所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：基因asm10来源于珍贵束丝放线菌ATCC31565。6.根据权利要求5所述的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于：在起始密码子前插入RBS位点序列ATCTGAGTTGAAGAGGTGACGTC。7.根据权利要求6所述的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于：步骤3)中，通过抗性筛选和PCR验证获得过量表达asm10基因的突变株。8.根据权利要求7所述的高...

【专利技术属性】
技术研发人员：于丽洁，白林泉，宁新娟，郭舒扬，
申请(专利权)人：辽宁斯韦尔生物科技有限公司，上海交通大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21