本发明专利技术公开了一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用，所述重组结节链霉菌是将SEQ ID NO.1所示卡那霉素抗性基因序列导入结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050获得的；通过导入卡那霉素抗性基因，使原本不具抗性的生产菌株带有卡那霉素抗性，提高种子培养基的菌种纯度和质量，实验室种子培养未出现染菌现象。通过表达功能基因透明颤菌血红蛋白(vhb)，提高AmB产量约15％；通过表达功能基因S‑腺苷甲硫氨酸合成酶基因(metk)，提高AmB产量约40％。
A recombinant Streptomyces of amphotericin B and its application
【技术实现步骤摘要】
一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用(一)
本专利技术涉及一种两性霉素B的生产方法，特别涉及一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用。(二)
技术介绍
两性霉素B(AmphotericinB，AmB)是一种多烯类广谱抗真菌抗生素，由结节链霉菌(Streptomycesnodosus)产生，其菌株于1955年从委内瑞拉奥里诺科河三角洲的土样中收集分离获得，并发现其具有抗真菌活性。1959年，在结节链霉菌发酵液中提取获得AmB。1966年开始上市，是第一个用于深部真菌感染的药物，已使用近半个世纪，目前仍然是临床上不可替代的抗真菌药物。AmB属于多稀大环内酯类抗生素，具有广谱性的对真菌抗性，特别是对于具有生命威胁性的全身性真菌感染例如白色念珠菌，曲霉属真菌等，同时还具有有效的抗病毒、寄生虫药性，例如阮病毒、利什曼原虫等。AmB多用于免疫系统损伤或免疫力较差患者，如器官移植接受者，HIV患者，以及使用抑制免疫力药物的肿瘤患者等。AmB分子式C47H73NO17，结构式如图1，熔点大于170℃，旋光度+420，在405、382、362、345、283、273、263、225mm紫外波长下具有吸收峰。AmB为黄色或橙黄色粉末，无味，有引湿性，在日光下易破坏失效。在二甲基亚砜中溶解，在二甲基甲酰胺中微溶，在甲醇中极微溶解，在水，无水乙醇，三氯甲烷或乙醚中基本不溶，(pH6-7)均少于1mg/L。AmB的抗真菌作用机制为：AmB能与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，在膜上形成微孔，使膜的通透性发生改变，最终导致重要的细胞内容物K离子、核苷酸、氨基酸等无节制的流失而造成菌体死亡。然而AmB也会在较小程度上与哺乳动物细胞膜上的胆固醇相互作用，造成一定的副作用，特别是肾毒性。虽然其具有一定的副作用，但AmB仍然是目前治疗人类深部全身性真菌感染的最重要一种抗生素。人们加强了对AmB新给药形式的研究，例如在20世纪90年代出现的Abelcet、Ambisome脂质体药物；Amphocil胶状悬浮液药物等AmB脂质体、乳剂、纳米粒子等新形式药物，为了降低毒性，提高药物到达作用区域的效率。现有的产AmB的菌株多为野生型筛选高产菌株，均无抗生素抗性，因此在工业发酵过程中会出现杂菌污染现象。卡那霉素(Kanamycin)是一种由卡那链霉菌(Streptomycekanamyceticus)产生的氨基糖苷类抗生素，其具有抗菌谱广、杀菌作用强、价格优廉等特点。其主要作为一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码翻译出现差错，进而致使细胞死亡。通过表达氨基糖苷磷酸转移酶，即卡那霉素抗性基因，可使菌种带有卡那霉素抗性。将卡那霉素抗性基因(kan)导入结节链霉菌(Streptomycesnodosus)，并在发酵生产过程中加入抗生素卡那霉素，能够降低染杂菌的概率，提升上罐发酵成功率，尤其在工业生产当中，能够降低上罐发酵的成本。部分功能基因对次级代谢产物表达具有正向作用。metk为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶编码基因。SAM合成酶在细菌、真菌、放线菌中均有发现，细胞内的SAM对于大多数链霉菌中分化与抗生素生产等具有重要作用。SAM可作为次级代谢产物的甲基供体，是嘧啶、腺苷、以及多种蛋白、小分子物质甲基化的来源，还可作为抗生素生产基因的转录激活因子。vhb透明颤菌血红蛋白，能够促进微生物细胞胞内氧的传输，提高氧的利用率，在有氧发酵过程中具有积极作用。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种带有抗生素抗性(卡那霉素)的产两性霉素B(AmB)结节链霉菌及其构建方法和应用，通过在结节链霉菌中表达外源基因即卡那霉素抗性基因，使结节链霉菌带有卡那霉素抗性，抵抗外界细菌污染，降低发酵不稳定现象，进而提高生产效率和产量；通过过表达透明颤菌血红蛋白(vhb)基因及S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(metk)，进一步提升结节链霉菌合成AmB的能力，有效提升AmB的产量。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种产两性霉素B的重组结节链霉菌，所述重组结节链霉菌是将SEQIDNO.1所示卡那霉素抗性基因序列(氨基酸序列为SEQIDNO.2所示)导入结节链霉菌(Streptomycesnodosus)ZJB2016050获得的；所述结节链霉菌(Streptomycesnodosus)ZJB2016050保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2017年7月17号，保藏编号CCTCCNO：M2017426，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。进一步，所述重组结节链霉菌还包含SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示外源基因，即将外源基因导入高产AmB的重组结节链霉菌。进一步，所述重组结节链霉菌是将SEQIDNO.1、SEQIDNO.7(透明颤菌血红蛋白基因)所示基因序列导入结节链霉菌(Streptomycesnodosus)ZJB2016050获得的。进一步，所述重组结节链霉菌是将SEQIDNO.1、SEQIDNO.8(S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因)所示基因序列导入结节链霉菌(Streptomycesnodosus)ZJB2016050获得的。本专利技术还提供一种所述产AmB的重组结节链霉菌在提高AmB产量中的应用。进一步，所述应用是将产AmB的重组结节链霉菌接种至发酵培养基，25-30℃(优选28℃)，220rpm发酵培养，获得含AmB的发酵液，将发酵液分离纯化，获得AmB；所述发酵培养基成分为：葡萄糖60-80g/L，牛肉膏5-10g/L，大豆蛋白粉5-10g/L，棉子粉8-12g/L，CaCO35-10g/L，KH2PO40.1-0.4g/L，溶剂为自来水，pH7.0，121度灭菌20min，优选：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO310g/L，KH2PO40.2g/L，溶剂为自来水，pH7.0。进一步，所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵条件为25-30℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌转速200-500rpm(优选400rpm)，通气比0.08-1.5vvm(优选1.2vvm)。进一步，所述产AmB的重组结节链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度2-10％(优选5％)的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将产AmB的重组结节链霉菌接种至GYM平板，28℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，12000rpm离心5min后去上清液，沉淀加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液；所述GYM平板终浓度组成：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂18g/L，溶剂为自来水，pH7.2；将孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，获得种子液；所述种子液培养基终浓度组成为：蛋白胨10-20g/L，NaCl5-10g/L，葡萄糖10-15g/L，酵母粉5-10g/L，CaCO30.5-1g/L，溶剂为自来水，pH7.0，121度灭菌20min，优选蛋白胨20g/L，NaCl8g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌是将SEQ ID NO.1所示卡那霉素抗性基因序列导入结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050获得的；所述结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年7月17号，保藏编号CCTCC NO：M 2017426，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.一种产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌是将SEQIDNO.1所示卡那霉素抗性基因序列导入结节链霉菌(Streptomycesnodosus)ZJB2016050获得的；所述结节链霉菌(Streptomycesnodosus)ZJB2016050保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年7月17号，保藏编号CCTCCNO：M2017426，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2.如权利要求1所述产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌还包含SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示外源基因。3.如权利要求2所述产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌是将SEQIDNO.1、SEQIDNO.7所示基因序列导入结节链霉菌ZJB2016050获得的。4.如权利要求2所述产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌是将SEQIDNO.1、SEQIDNO.8所示基因序列导入结节链霉菌(Streptomycesnodosus)ZJB16050获得的。5.一种权利要求1所述产两性霉素B的重组结节链霉菌在提高两性霉素B产量中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用是将产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至发酵培养基，25-30℃，220rpm发酵培养，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得两性霉素B；所述发酵培...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑裕国，柳志强，张博，黄恺，周奕腾，张海东，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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