一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌技术

本发明专利技术提供了一种显著提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸水平的方法及工程菌。本发明专利技术采用分子生物学技术，通过基因工程改造增加PEP与E4P合成水平，并切断莽草酸下游代谢途径，提高地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)中莽草酸的产量。本发明专利技术构建了地衣芽胞杆菌产莽草酸工程菌WX‑02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY‑aroD。该菌株在优化培养基和培养条件下可以显著提高莽草酸的合成，终产量高达16.78g/L。本发明专利技术通过敲除pyk，aroK与pgi和过表达aroD基因的组合以及发酵工艺优化实现了地衣芽胞杆菌高产莽草酸。

A method for improving the production of shikimic acid by Bacillus licheniformis and its engineering bacteria

The present invention provides a method and engineering bacteria to significantly improve the fermentation of Bacillus licheniformis to produce shikimic acid level. The invention adopts the technology of molecular biology, PEP and increased the level of E4P synthesis by means of genetic engineering, and cut off the shikimic acid pathway downstream, improve Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis) in the production of shikimic acid. The present invention is constructed of Bacillus licheniformis producing shikimic acid engineering bacteria WX 02 Delta PYK Delta aroK Delta pgi/pHY aroD. The strain can significantly improve the synthesis of shikimic acid under the optimized medium and culture conditions, and the final yield is up to 16.78g/L. The invention optimizes the high yield shikimic acid of Bacillus licheniformis by knocking the PYK, the combination of the aroK and PGI, the overexpression of the aroD gene and the fermentation process.

【技术实现步骤摘要】
一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌
本专利技术涉及基因工程和微生物代谢工程
，具体涉及一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌。
技术介绍
莽草酸作为一种传统中药具有消炎、镇痛和抗血栓的作用，是许多抗癌药物的中间体，也是合成预防和治疗禽流感药物神经氨酸酶抑制剂“达菲”的关键原材料。莽草酸途径仅存在于植物和微生物中，是细菌代谢的支路途径，但其部分产物是人体所必需的，例如L-苯丙氨酸是人体和动物不能靠自身合成的必需氨基酸，所以其中间体及产物具有很好的应用前景。据文献报道，利用细菌生产莽草酸的研究主要集中在E.coli。然而革兰氏阴性菌产生的脂多糖具有毒性，因此生产的莽草酸需要进行工艺复杂的脱毒处理。而本专利技术方法选择公认安全(GRAS)的革兰氏阳性菌株地衣芽胞菌B.licheniformisWX-02作为莽草酸的生产菌株，该菌株具有生产莽草酸的潜力，并且具有安全生产能力，能大大降低生产莽草酸的经济成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种显著提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌，以地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02为对象。敲除了PEP节点处的关键酶丙酮酸激酶的基因，构建pyk缺陷菌株。另一方面以积累莽草酸为目的，在WX-02Δpyk中敲除莽草酸激酶编码基因aroK，切断莽草酸后续反应，使中间产物莽草酸得到有效积累。再者，在WX-02ΔpykΔaroK基础上敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，增加莽草酸的前体物E4P的含量。在此菌株基础上通过过表达莽草酸-5-脱氢酶基因aroD解除莽草酸反馈抑制而积累莽草酸。本专利技术第一方面提供了一种高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，所述工程菌是将地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株，再将枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168的P43启动子、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD和淀粉酶基因amyL的终止子连接至表达载体得到重组质粒，再将重组质粒转化WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株得到高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。积累莽草酸代谢途径中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)，过表达莽草酸途径基因，致使莽草酸合成的有效碳通量增加，同时，敲除掉丙酮酸激酶基因pyk，莽草酸下游代谢的第一个基因是莽草酸激酶基因aroK，以及糖酵解途径中的重要基因6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，过表达莽草酸脱氢酶基因aroD，增加地衣芽胞杆菌中莽草酸的产量。具体的，所述地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk序列如SEQIDNO：1所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的莽草酸激酶编码基因aroK序列如SEQIDNO：2所示；所述地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)WX-02的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi序列如SEQIDNO：3所示；所述枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168的P43启动子序列如SEQIDNO：4所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD序列如SEQIDNO：5所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的淀粉酶基因amyL的终止子序列如SEQIDNO：6所示。所述地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02保存于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M208065，保藏日期为2008年4月28日。优选的，所述表达载体为pHY300PLK。本专利技术第二方面提供了上述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方法，步骤包括：S1、将地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02敲除丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株；S2、以枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出P43启动子；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出莽草酸脱氢酶基因aroD；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL的终止子序列；S3、将P43启动子、莽草酸脱氢酶基因aroD及淀粉酶基因amyL的终止子片段通过SOE-PCR的方法连到一起，然后通过限制性内切酶连接到表达载体pHY300PLK中，构建重组质粒pHY-aroD；S4、将pHY-aroD转化至地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi，得高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。优选的，步骤S1中，敲除丙酮酸激酶基因pyk的方法包括：以地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增丙酮酸激酶基因pyk敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒T2Δpyk，将T2Δpyk电转到地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02中后进行单交换，验证正确后进行双交换传代筛选菌株,pyk缺失菌株构建成功并命名为WX-02Δpyk。更加优选的，步骤S1中，敲除莽草酸激酶编码基因aroK的方法包括：以地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增莽草酸激酶编码基因aroK敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒T2ΔaroK，将T2ΔaroK电转到WX-02Δpyk中后进行单交换，验证正确后进行双交换传代筛选菌株,pyk、aroK缺失菌株构建成功并命名为WX-02ΔpykΔaroK。进一步优选的，步骤S1中，敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的方法包括：以地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒T2Δpgi，将T2Δpgi电转到WX-02ΔpykΔaroK中后进行单交换，验证正确后进行双交换传代筛选菌株,pyk、aroK、pgi缺失菌株构建成功并命名为WX-02ΔpykΔaroKΔpgi。本专利技术第三方面提供了一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法，步骤包括：将上述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD进行种子培养，再进行发酵培养，所述发酵培养基为：葡萄糖10-80g/L，柠檬酸钠2-20g/L，酵母粉1-25g/L，K2HPO41-10g/L，KH2PO41-10g/L，MgSO40.1-5g/L，MnC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是将地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX‑02的丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6‑磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，构建WX‑02ΔpykΔaroKΔpgi菌株，再将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168的P43启动子、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX‑02的莽草酸脱氢酶基因aroD和淀粉酶基因amyL的终止子连接至表达载体得到重组质粒，再将重组质粒转化WX‑02ΔpykΔaroKΔpgi菌株所得到的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX‑02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY‑aroD。

【技术特征摘要】
1.一种高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是将地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株，再将枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168的P43启动子、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD和淀粉酶基因amyL的终止子连接至表达载体得到重组质粒，再将重组质粒转化WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株所得到的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。2.如权利要求1所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述地衣芽胞杆菌WX-02的丙酮酸激酶基因pyk序列如SEQIDNO：1所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的莽草酸激酶编码基因aroK序列如SEQIDNO：2所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi序列如SEQIDNO：3所示；所述枯草芽胞杆菌168的P43启动子序列如SEQIDNO：4所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD序列如SEQIDNO：5所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的淀粉酶基因amyL的终止子序列如SEQIDNO：6所示。3.如权利要求1所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述表达载体为pHY300PLK。4.如权利要求1所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述地衣芽胞杆菌WX-02保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：M208065。5.权利要求1所述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤包括：S1、将地衣芽胞杆菌WX-02敲除丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株；S2、以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出P43启动子；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出莽草酸脱氢酶基因aroD；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL的终止子序列；S3、将P43启动子、莽草酸脱氢酶基因aroD及淀粉酶基因amyL的终止子片段通过SOE-PCR的方法连到一起，然后通过限制性内切酶连接到表达载体pHY300PLK中，构建重组质...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勤，陈守文，左思奇，张媛，张小栋，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42