一种高亲和力EDB‑FN蛋白靶向肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种纤连蛋白EDB亚型特异性的靶向短肽A16，其氨基酸序列为ATYRLFQGVEVV。本发明专利技术所述靶向短肽A16能特异性识别肿瘤细胞表达的EDB‑FN蛋白，对EDB‑FN的亲和力高，能携带具有诊断或治疗活性的功能分子到肿瘤细胞上，发挥诊断或治疗作用。

A high affinity EDB FN protein targeting peptide and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高亲和力EDB-FN蛋白靶向肽及其应用
本专利技术属于分子生物学和免疫学
，具体涉及噬菌体展示肽库技术和重组表达技术，特别是涉及一种高亲和力EDB-FN蛋白靶向肽的筛选、鉴定、制备及应用。
技术介绍
众所周知，恶性肿瘤都处在一个独一无二的微环境中，促进肿瘤细胞的生长、发散与转移。在肿瘤细胞外基质中通常会异常的高表达与肿瘤相关的蛋白，其中，纤连蛋白(fibronectin)是肿瘤细胞外基质中最重要的蛋白之一，在肿瘤的发生、生长与转移的过程中起关键作用。另外，在长期的科学研究中发现，纤连蛋白的一个重要的亚型extradomain-Bfibronectin(EDB-FN)在病人体内与肿瘤的生长过程高度相关，成为医学界公认的肿瘤发生与上皮间质分化重要生物标志物。EDB蛋白在人体大多数肿瘤中都有很高的表达，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌以及淋巴瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤等。所以，EDB是一个极具发展前景的标志物对于肿瘤的精准检查、诊断以及治疗。短肽对人体的生理过程(激素、神经递质、生长因子、离子通道配体以及抗感染)有着重要的作用。目前，得到确认的天然多肽超过7000条。通常短肽可以作为细胞表面受体高亲和性的信号分子，可以触发细胞内效应。由于短肽具有诱惑力的药理作用以及成本低的特点，一种新型的短肽靶向药物以及肿瘤精准成像正在成为医药领域的热门研究方向。应用短肽筛选技术获得与EDB蛋白具有高度结合力的十二肽具有广阔的应用前景。噬菌体展示技术是一种快速高通量的蛋白多肽展示技术，利用噬菌体展示技术，能快速高通量的筛选高亲和的靶向抗体及功能性多肽。目前利用随机合成的方法，可以将多达109的不同多肽序列展示到噬菌体表面，建立起一个大库容的多肽库，通过优化筛选方法有可能筛选出不同需求的短肽分子。短肽分子较小易于穿膜，但通常亲和力较低，特别是当携带其它分子时经常发生脱靶现象。能否获得高亲和力的靶向多肽，除了受到筛选方法的条件和参数影响以外，很大程度上取决于随机因素。另外，短肽分子结构相对简单，作为靶向标记物时特异性通常也不高，特异性不足也影响了短肽作为靶向分子的应用。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术通过多次对噬菌体随机肽库进行反复筛选，获得了一条对EDB-FN蛋白具有特异靶向性、高度亲和力的十二肽，并验证了其携带诊断标记特异性靶向表达EDB-FN的肿瘤细胞的功能。一方面，一种EDB-FN蛋白靶向肽A16，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术所述EDB-FN蛋白靶向肽还可以在SEQIDNO:1的基础上进一步通过氨基酸的取代、缺失、添加衍生，优选在SEQIDNO:1的基础上进行1、2、3个氨基酸的取代、缺失、添加，例如在1个位点上进行氨基酸保守性取代。第二方面，本专利技术提供一种缀合物，包含靶向部分和功能性部分，其特征在于所述靶向部分为所述靶向肽A16。本专利技术所述的缀合物，其特征在于所述缀合物中含有一个或多个拷贝的靶向肽A16。本专利技术所述的缀合物，其特征在于所述功能性部分包括选自由诊断标记、化疗药物、活性分子组成的组。本专利技术所述的缀合物，其特征在于所述缀合物的各组件之间可直接连接或通过接头连接，例如所述功能性部分与所述靶向部分之间、所述多个功能性部分之间、所述多个靶向部分之间直接连接或通过接头连接。所述直接连接优选为肽键直接连接；所述接头连接的接头例如(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，其中n为2-6。第三方面，本专利技术提供一种核酸，其编码：(1)本专利技术所述EDB-FN蛋白靶向肽A16；或(2)本专利技术所述缀合物。本专利技术所述核酸既包括适应于原核细胞表达、经过原核密码子优化的核酸(例如使用大肠杆菌密码子等)，也包括适应于真核细胞表达、经过真核密码子优化的核酸(例如使用酵母密码子、哺乳动物细胞密码子等)。本专利技术所述核酸可为核糖核酸(RNA)，也可为脱氧核糖核酸(DNA)。第四方面，本专利技术提供一种核酸构建体，其包含本专利技术所述的编码核酸。本专利技术所述核酸构建体中，所述编码核酸可操作的连接至启动子下游，并且含有原核和/或真核复制起始序列。本专利技术所述核酸构建体可以为表达盒、操纵子、质粒、粘粒、病毒/噬菌体载体等。第五方面，本专利技术提供一种宿主细胞，其包含本专利技术所述编码基因、或包含本专利技术所述核酸构建体；本专利技术所述宿主能够表达本专利技术所述EDB-FN蛋白靶向肽A16或本专利技术所述包含EDB-FN蛋白靶向肽A16的缀合物。本专利技术所述宿主，可以为基因工程领域常用的宿主，包括原核宿主、真核宿主。所述原核宿主包括但不限于大肠杆菌，所述真核宿主包括但不限于酵母(毕赤酵母、酿酒酵母)、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。第六方面，本专利技术提供一种生产所述EDB-FN蛋白靶向肽A16或所述包含EDB-FN蛋白靶向肽A16的缀合物的方法，包括：(1)制备本专利技术所述重组宿主细胞；(2)在适合的条件下培养步骤(1)的宿主细胞，使其增殖；(3)宿主细胞的状态和数量达到满足生产需求时，在适合重组生产EDB-FN蛋白靶向肽A16或其缀合物的条件下培养宿主细胞；(4)从宿主细胞产物中分离纯化包含EDB-FN蛋白靶向肽A16或缀合物的级份。第七方面，本专利技术提供所述EDB-FN蛋白靶向肽A16缀合物或其缀合物的用途，其用于制备检测或诊断EDB-FN蛋白的试剂盒。本专利技术所述EDB-FN蛋白靶向肽A16缀合物或其缀合物的用途，还可以用于制备诊断或治疗与EDB-FN蛋白异常表达相关的肿瘤的药物；所述与EDB-FN蛋白异常表达相关的肿瘤包括包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌以及淋巴瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有以下优点：(1)分子较小，易于递送。本专利技术所述EDB-FN蛋白靶向肽A16仅有12个氨基酸的长度，容易递送和分布，从而能够对表达EDB-FN蛋白的肿瘤细胞进行检测和追踪，且不引起过敏反应、不易被患者免疫系统清除。克服了现有技术以抗体分子作为靶向剂递送困难、易引起过敏反应、持续时间短快速被清除的技术问题。(2)亲和力高，不易脱靶。本专利技术所述EDB-FN蛋白靶向肽A16是通过多次对噬菌体随机肽库进行反复筛选获得的对EDB-FN蛋白具有特异靶向性、高度亲和力的十二肽。动力学实验结果表明，重组表达的A16与EDB-FN的Kd值达到了1.92×10-7。(3)耐受性好，不易失活。本专利技术所述EDB-FN蛋白靶向肽A16通过线性结构模拟的方式实现对肿瘤细胞EDB-FN的结合，对空间构象的依赖较低，从而能耐受其他功能活性分子的缀合，可位于缀合物的任意位置如N端、C端、中间。另外，本专利技术的EDB-FN蛋白靶向肽A16还可以多拷贝串联使用，从而进一步增加靶向性和可靠性。(4)特异性高，能识别并结合表达EDB-FN的肿瘤细胞。本专利技术通过噬菌体随机展示肽库筛选到的EDB-FN蛋白靶向肽A16能够特异性结合表达EDB-FN的U87细胞，而不结合EDB-FN阴性的293T细胞。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术的限制。在附图中：图1：PHAGE-ELISA试验结果。横坐标1-12为挑取的阳性克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EDB‑FN蛋白靶向肽A16，其序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种EDB-FN蛋白靶向肽A16，其序列如SEQIDNO:1所示。2.一种缀合物，包含靶向部分和功能性部分，其特征在于所述靶向部分为权利要求1所述靶向肽A16。3.如权利要求2所述的缀合物，其特征在于所述缀合物中含有一个或多个拷贝的靶向肽A16。4.如权利要求2所述的缀合物，其特征在于所述功能性部分包括选自由诊断标记、化疗药物、活性蛋白组成的组。5.如权利要求2至4任一所述的缀合物，其特征在于所述缀合物的各组件之间可直接连接或通过接头连接，例如所述功能性部分与所述靶向部分之间、所述多个功能性部分之间、所述多个靶向部分之间直接连接或通过接头连接，所述直接连接优选肽键直接连接。6.一种核酸，其编码：(1)权利要求1所述EDB-FN蛋白靶向肽A16；或(2)权利要求2至5任一所述缀合物。7.一种核酸构建体，其包含权利要求6所述核酸。8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述核酸、或包含权利要求7...

【专利技术属性】
技术研发人员：林坚，陈航宇，李承鹏，周斌，陈鹏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11