枯草芽孢杆菌突变株、选育方法和该菌在发酵法生产腺苷中的应用。解决现有腺苷的生产成本高、污染严重，推广应用受到严重限制的问题。本发明专利技术以枯草芽孢杆菌ＴＸ－１为出发菌株，经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）诱变处理后再在培养基中添加异亮氨酸和缬氨酸作为补充营养物质，经培养筛选和复筛获得，对其遗传标记进行验证，确定其仍具有６－巯基嘌呤抗性，其遗传标记为Ｉｌｅ↑［－］＋Ｖａｌ↑［－］＋６－ＭＰ↑［ｒ］。其在腺苷生产中的应用是，接一环ＨＪ０４１３０于２５－３５ｍＬ／５００ｍＬ盛有发酵培养基的锥形瓶中，３０－３４℃，转速２００－２４０ｒｐｍ下，发酵培养４８－６４小时，制得腺苷。该菌种表现出积累更高水平腺苷的能力，该生产方法原料来源广泛、成本低、产品纯度高、反映条件温和，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物工程
，特别是腺苷生产菌即枯草芽孢杆菌突变株，以及其选育方法和用该菌发酵法生产腺苷。
技术介绍
腺苷(Adenosine)属于重要的核苷酸衍生物，在生理生化过程中起着重要的调控作用，具有广泛的药用价值。在美国，腺苷是经FDA批准的治疗PSVT的一线药物，也是经FDA批准的用于心脏药物负荷试验的两种药物之一，已成为急诊处理快速性心律失常和药物负荷试验的常规用药。发酵法大规模生产出腺苷在我国尚属空白，目前国内腺苷的生产主要是化学法和酶法，成本高、污染严重，推广应用受到严重的限制。原料来源广泛、成本低、产品纯度高、反映条件温和的发酵法已是研究的大势所趋。许多大专院校和研究机构都在从事此领域的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有腺苷的生产成本高、污染严重，推广应用受到严重限制的问题，提供一种腺苷生产菌的选育及其选育方法和用该菌发酵法生产腺苷。本实验室(天津科技大学代谢控制发酵研究室)利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 6872(保藏于美国菌种保藏中心)经多次改良获得一株肌苷生产菌TX-1(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC-10082)，，是腺嘌呤(Ade)、组氨酸(His)、黄嘌呤(Xan)的营养缺陷型，即需要这些营养物质才能维持生长和积累高水平的肌苷。同时枯草芽孢杆菌TX-1还具有8-氮鸟嘌呤(8-AG)、6-巯基嘌呤(6-MP)、磺胺胍(SG)抗性。通过测定，其腺苷产量几乎为零。本专利技术在枯草芽孢杆菌TX-1的基础上提出一种突变株Hj04130，即本菌株是以枯草芽孢杆菌TX-1为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)诱变处理后再在培养基中添加异亮氨酸和缬氨酸作为补充营养物质，经培养筛选和复筛获得，对其遗传标记进行验证，确定其仍具有6-巯基嘌呤抗性，其遗传标记为Ile-+Val-+6-MPr。本专利技术以枯草芽孢杆菌TX-1为出发菌株，旨在利用TX-1从葡萄糖到肌苷酸代谢主流的高通量来奠定进一步提高腺苷的产量的基础。枯草芽孢杆菌HJ04130的选育方法，包括1)出发菌株选取选取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TX-1，是腺嘌呤(Ade)、组氨酸(His)、黄嘌呤(Xan)的营养缺陷型，同时TX-1还具有8-氮鸟嘌呤(8-AG)、6-巯基嘌呤(6-MP)、磺胺胍(SG)抗性；2)培养基的配制——斜面培养基牛肉膏8-20g，蛋白胨2-5g，酵母浸膏粉3-7g，NaCl1.0-5.0g，琼脂15-30g，自来水定容至1L，pH7.0-7.2；—种子培养基葡萄糖30-60g，KH2PO42.0-5.0g，MgSO4·7H2O 0.5-0.8g，NH4Cl 3.0-6.0g，FeSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·7H2O 0.005-0.02g，豆饼水解液30-50ml，酵母浸膏粉0.1-0.7，尿素1.0-4.0，鸟嘌呤0.05-0.2g，自来水定容至1L，pH7.0-7.2；——发酵培养基葡萄糖70-100g，KH2PO40.5-3.0g，NHCl 10-25g，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g，豆饼水解液30-50ml，FeSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·H2O 0.005-0.02g，鸟嘌呤0.05-0.2g，CaCl23-8g，CaCO320-35g，摇瓶时添加；异亮氨酸和缬氨酸各自的添加量为0-0.04g，自来水定容至1L，pH7.0-7.2；——基本培养基(MM)葡萄糖l0-30g，NH4Cl 3-8g，KH2PO40.5-2g，MgSO40.2-0.5g，柠檬酸钠0.2-1.0g，谷氨酸钠0.5-2.0g，FeSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·H2O 0.005-0.02g，pH7.0-7.2；——筛选培养基在MM培养基的基础上添加0.015-0.040g异亮氨酸和0.015-0.040g缬氨酸；——完全培养基(CM)葡萄糖0.5-5g，蛋白胨5-15g，牛肉膏5-15g，酵母膏3-10g，NaCl 5-20g，pH7.0-7.2；——基本培养基、筛选培养基、完全培养基在配制固体平板培养基时须添加1.5-3.0％的琼脂；3)突变株的诱变和分离筛选——从新鲜斜面上接一环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TX-1菌种入种子培养基25-35mL/500mL锥形瓶，在30-34℃、160-200r/min下培养12-16h；——离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤。然后，用0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸缓冲液洗涤一次后，将打散的细胞悬液悬浮于20-30ml含有1.5-2.5ml硫酸二乙酯(DES)的0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸缓冲液溶液中，30-34℃下振荡处理0.25-1h；——反应用10-15mL的硫代硫酸钠溶液稀释10倍终止反应，离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤后将其接入种子培养基中作中间培养24小时；——然后稀释涂布CM平板，30-34℃下培养48h；——挑去CM平板上菌落圈大的菌落，对应点种在CM、MM平板和筛选平板，挑取CM和筛选平板上生长而在MM平板上不生长的菌落或生长较微弱的菌落，接种于斜面培养基，于30-34℃培养12-48h；——然后，每株接一环入发酵培养基，根据腺苷产量的高低来确定复筛用的菌株，复筛前，对复筛用菌株的氨基酸缺陷型遗传标记要进行确认，复筛时，将每株菌在斜面上连续传代十次，每株接3瓶发酵培养基，考察每一代的腺苷生产能力，根据腺苷产量高低和产苷稳定性来筛选确定菌株，得到HJ04130异亮氨酸和缬氨酸缺陷腺苷生产菌。——以枯草芽孢杆菌HJ04130作为发酵法生产腺苷的菌株，接一环HJ04130于25-35mL/500mL盛有发酵培养基的锥形瓶中，30-34℃，转速200-240rpm下，发酵培养48-64小时，制得腺苷。本专利技术优点和积极效果从枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)TX-1选育的异亮氨酸和缬氨酸缺陷型菌株HJ04130，表现出积累更高水平腺苷的能力，这是由于相对于出发菌株来说其IMP脱氢酶活力被降低了许多，在培养基中添加微量异亮氨酸和缬氨酸激活了IMP脱氢酶。用该菌已通过摇瓶水平、5L发酵罐水平的发酵法生产腺苷的试验，具有一定的工业实用性价值。本专利技术提供的腺苷生产方法原料来源广泛、成本低、产品纯度高、反映条件温和。具体实施方式实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJ04130的选育方法1)出发菌株选取选取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TX-1；2)培养基的配制——斜面培养基牛肉膏10g，蛋白胨4g，酵母浸膏粉5g，NaCl 2.5g，琼脂20g，自来水定容至1L，pH7.0；——种子培养基葡萄糖40g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 0.6g，NH4Cl5.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·7H2O 0.01g，豆饼水解液40ml，酵母浸膏粉0.5，尿素2.0，鸟嘌呤0.1g，自来水定容至1L，pH7.0；——发酵培养基葡萄糖80g，KH2PO41.0g，NH4Cl 15g，MgSO4·7本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）突变株ＨＪ０４１３０，本菌株是以枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＸ－１（保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ＣＩＣＣ－１００８２）为出发菌株，经硫酸二乙 酯（ＤＥＳ）诱变处理后再在培养基中添加异亮氨酸和缬氨酸作为补充营养物质，经培养筛选和复筛获得，对其遗传标记进行验证，确定其仍具有６－巯基嘌呤抗性，其遗传标记为Ｉｌｅ↑［－］＋Ｖａｌ↑［－］＋６－ＭＰ↑［ｒ］。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宁，黄金，刘淑云，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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