一种用于检测烟草黑胫病菌的引物、探针及实时荧光ＰＣＲ试剂盒，所述的引物包括正向引物Ｐｎ１和反向引物Ｐｎ２，其特征在于其碱基序列分别是：Ｐｎ１：５’－ＧＡＡ ＣＡＡ ＴＧＣ ＡＡＣ ＴＴＡ ＴＴＧ ＧＡＣ ＧＴＴ－３’，Ｐｎ２：５’－ＡＡＣ ＣＧＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＣＣＴ ＡＣ－３’。所述的探针的碱基序列是在５’－ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＧＣ ＣＡＣ ＡＧＣ－３’两端向上游移位２个碱基或下游移位３个碱基区域内的任意一条核苷酸序列，在该条核苷酸序列上，荧光报告基团标记在５’端，荧光淬灭基团标记在３’端，以构成荧光标记探针。并用上述的引物和探针制备成相应的试剂盒。本发明专利技术能在田间带病土壤中快速、准确地检测烟草黑胫病菌，从而为及时采取措施切断病害的侵染源提供准确依据，也可以快速、准确地检测植株上的病害，其意义十分重大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种适合于农业生产、植物保护等部门使用的生物工程技术，特别是一种用于检测烟草生产中的重大毁灭性病害——烟草黑胫病病原真菌烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒。(二)、技术背景烟草黑胫病是影响全球烟草产业发展的重大毁灭性病害，在我国各地发生较为普遍。该病害可以危害包括烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟及香料烟等所有的栽培烟草，可以在烟草的任何生育阶段侵染危害，但主要危害大田期烟株，苗期发病往往造成烟苗成片死亡，成猝倒状，大田期发病则可以造成整个烟株突然凋萎并伴有根部或茎基部变黑症状，常造成无法挽救的损失。此病害以土传为主，风雨、流水、农事操作等都是其传播途径。对于烟草黑胫病菌的检测方法有典型症状目测法、组织病理切片法、致病性测定法等常规检测方法。常规方法的优点在于直观、简便易行，但其缺点在于检测周期长，经验不足者误判率高，而且不能在病原侵染初期进行检测。此外，对烟草黑胫病菌的检测还有酶联免疫吸附法、斑点免疫吸附法等，但存在过程复杂、灵敏度低、检测成本高、周期较长等问题。继常规PCR检测技术之后，新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板量准确定量、灵敏度高、特异性强、闭管操作、简便迅速等优点，已经成为国内外分子生物学研究中的主流技术，它同样也在植物病原体的检测和诊断中逐渐得到了广泛使用。近年来国内外陆续开始将实时荧光PCR技术应用于植物病害诊断检测。实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7％的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。实时荧光PCR根据其产生荧光的原理分为使用探针和不使用探针的两类方法。由于探针与待检测病原菌DNA序列有很高的特异性，而且可以有效避免常规PCR的假阳性问题，所以目前使用较为普遍的是荧光标记探针法。实时荧光PCR检测方法用于植物病原菌的检测，在国内外都还是刚刚起步。目前，在烟草黑胫病菌的实时荧光PCR检测中，以5’-GAA CAA TGCAAC TTA TTG GAC GTT-3’和5’-AAC CGA AGC TGC CAC CCT AC-3’为引物、以在5’-TTC ACC AGT CCA TCA CGC CAC AGC-3’两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列为探针制备成相应的实时荧光PCR试剂盒，尚无相关报道。(三)、
技术实现思路
本专利技术的目的之一就是提供一种用于检测烟草黑胫病菌的引物，它可以在PCR检测过程中，定性检测烟草黑胫病菌，而且特异性强。本专利技术的目的之二就是提供一种用于检测烟草黑胫病菌的探针，它可以在实时荧光PCR检测过程中，定量检测烟草黑胫病菌，显著地提高检测灵敏度。本专利技术的目的之三就是提供一种利用目的一中的引物和目的二中的探针制成的检测烟草黑胫病菌的试剂盒，可以在实时荧光PCR检测过程中，快速、准确地定量检测土壤中和植株上的烟草黑胫病菌，而且稳定可靠、灵敏度高。本专利技术的第一个目的是通过这样的技术方案实现的，它包括正向引物Pn1和反向引物Pn2，其特征在于其碱基序列分别是Pn15’-GAA CAA TGC AAC TTA TTG GAC GTT-3’Pn25’-AAC CGA AGC TGC CAC CCT AC-3’。经过长期大量的实验，从众多用于检测烟草黑胫病菌的PCR引物中筛选出上述的由正向引物Pn1和反向引物Pn2组成的引物，其扩增片段大小为120 bp。该引物的特点是对烟草黑胫病菌具有高度的保守性，与其它近缘生物种之间不具有显著的同源性，用该引物进行PCR扩增，实现烟草黑胫病菌的准确定性检测，且特异性强。本专利技术的第二个目的是通过这样的技术方案实现的，它的碱基序列是在5’-TTC ACC AGT CCA TCA CGC CAC AGC-3’两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列，在该条核苷酸序列上，荧光报告基团标记在5’端，荧光淬灭基团标记在3’端，以构成荧光标记探针。在由正向引物Pn1和反向引物Pn2组成的引物的扩增区域内，按照探针的设计原理和设计方法，设计出用于烟草黑胫病菌实时荧光PCR检测的探针，它的碱基序列是在5’-TTC ACC AGT CCA TCA CGC CAC AGC-3’两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列；用所设计的所有探针进行实时荧光PCR扩增，对所设计的探针进行筛选；根据实时荧光PCR扩增的结果，最后筛选出最佳探针，其核苷酸序列是5’-TTC ACC AGT CCA TCA CGCCAC AGC-3’。在荧光标记探针的5’端标记有报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR进行，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号，报告基团所释放的荧光可以被定量检测仪内的荧光计检测，模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。Ct值是PCR过程中荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确地定量被检测样品中烟草黑胫病菌的浓度，从而显著提高检测灵敏度。本专利技术的第三个目的是通过这样的技术方案实现的，它包括有待测样品提取试剂、定量标准品、实时荧光PCR反应液和检测用品，其特征在于实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相对应的终浓度PCR缓冲液10％；MgCl22.5mmol/L；dNTPs0.3mmol/L；Taq DNA聚合酶1U/25μL；正向引物Pn10.4μmol/L；反向引物Pn20.4μmol/L；荧光标记探针0.2μmol/L；采用无菌双蒸水调整浓度。待测样品提取试剂由TES缓冲液和TE缓冲液组成，TES缓冲液和TE缓冲液均是常规试剂，是根据《精编分子生物学实验指南(第四版)》中相关方法配制而成的。定量标准品包括基于烟草黑胫病菌特有核酸序列设计的标准阳性对照模板、无烟草黑胫病菌土样和健康植株阴性对照模板。标准阳性对照模板由含有插入目标片段的pUCm-T(购自Sangon公司)载体制备而成。制备过程为采用引物ITS4和ITS5扩增烟草黑胫病菌的ITS区，PCR产物电泳后切下含有目标片段的凝胶，目标片段用凝胶回收试剂盒回收纯化后与pUCm-T载体16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化产物涂平板培养，挑取白斑，采用引物Pn1-Pn2进行PCR鉴定。阳性克隆通过序列分析进一步鉴定结果的可靠性。选择PCR和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测烟草黑胫病菌的引物，它包括正向引物Ｐｎ１和反向引物Ｐｎ２，其特征在于其碱基序列分别是：Ｐｎ１：５’－ＧＡＡＣＡＡＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＧＴＴ－３’Ｐｎ２：５’－ＡＡＣＣＧＡ ＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＴＡＣ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊丽，李常军，吴金钟，肖崇刚，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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