一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法技术

本发明专利技术公开了一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，涉及转基因工程技术领域。本发明专利技术公开的转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法以为含有甘油的生理盐水作为保存试剂，将保存试剂加入至含目标菌的菌液中，分装于已灭菌的EP管中，并立即置于‑80℃～‑20℃条件下进行低温保存；该保存方法操作简单、存放时间长、占用空间小、成本低廉、一次冻存多管小量分装，方便管理，防止反复冻融造成菌体死亡和杂菌污染，提高菌体成活率；且经过长时间的保存仍然保持与原代菌种相同的活力和纯度，对维持菌种和质粒的稳定性起到重要的保存作用。

A method for preservation of genetically engineered strains of hepatitis E virus

The invention discloses a method for preserving genetic engineering bacteria of hepatitis E virus (HEV), which relates to the technical field of transgenic engineering. The invention discloses a method of preserving transgenic swine hepatitis virus gene engineering bacteria that saline containing glycerol as preservation reagent, save reagent added to the bacteria containing target bacteria, packed in sterilized EP tube, and immediately placed in 80 ~ under 20 DEG C for cryopreservation; the method has the advantages of simple operation, long storage, small occupied space, low cost, a small amount of frozen tube packaging, easy management, prevent repeated freezing and thawing caused the death of the cell and bacteria pollution, improve the survival rate of bacteria; and after a long time preservation still remain the same with the primary bacterial viability and purity. To hold an important role in maintaining the stability of the strains and plasmids.

【技术实现步骤摘要】
一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法
本专利技术涉及转基因工程
，具体而言，涉及一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法。
技术介绍
戊型肝炎(HepatitisE)是一种由戊型肝炎病毒(HEV)引起的急性病毒性肝炎，主要通过粪-口消化道传播。戊型肝炎呈全球分布，以暴发流行或散发感染的形式存在，在世界范围，无论HEV在这个地区是否流行，猪感染HEV的现象非常普遍。HEV主要包括1～4个基因型，其中，基因4型具有人兽共患的性质，在人群和猪群中，主要以基因4型HEV感染为主。研究发现从猪体内分离的基因4型HEV能够感染人，反之亦然，并且基因4型HEV对人的致病性较其他基因型更强，危害也更大。因此，对戊型肝炎病毒的深入研究和防制在公共卫生方面具有重要意义。在研究戊型肝炎病毒的过程中，通常需要利用转基因工程技术对猪戊型肝炎病毒的各种基因进行深入研究。需要将导入有外源戊型肝炎病毒基因的基因工程菌进行保存，以供后期研究、交换和使用等需求。而菌种在保存过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，这样才能在一定的时间内不发生变异而又保持生物活性。目前比较常用的菌种保存方法包括真空冷冻干燥法、琼脂斜面低温保存法、脱纤维羊血冷冻保存法，液体石蜡保存法。其中真空冷冻保存法效果最好，但对于设备要求高，成本高，制备过程复杂。琼脂斜面低温保存法，操作简便、易于推广，适用范围广，缺点是需经常传代，且易发生污染，保藏期短，而且不适用于对营养要求高的细菌。脱纤维羊血冷冻保存法，这一方法使用的羊血对一般实验室来说不易获得，不能广泛推广使用。液体石蜡保存法，对细菌保存效果差。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，该保存方法可以有效地提高目标工程菌的存活率，延长其保存时间，可长时期地维持工程菌中外源质粒的稳定性以及工程菌自身的活力和纯度，且该保存具有操作简单、成本低等特点。本专利技术是这样实现的：一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，其包括：将保存试剂加入至含目标菌的菌液中，得到目标菌保存液；将目标菌保存液分装于已灭菌的EP管中，并立即置于-80℃～-20℃条件下进行低温保存；其中，目标菌为转化有外源质粒的转基因工程菌，外源质粒含有猪戊型肝炎病毒基因序列；保存试剂为含有甘油的生理盐水。采用甘油-生理盐水保存法，其可以维持工程菌细胞内外的渗透压平衡，避免工程菌因失水或吸水溶胀两种现象而导致的死亡，提高存活率；同时，在生理盐水中加入的甘油可以避免在低温状态下因水分结冰对菌体造成的物理伤害，提高菌体的存活率；而将目标菌保存液置于-80℃～-20℃低温条件保存，可以减缓菌体体内的酶活，降低其新陈代谢，延缓其衰老的时间，进而实现其长期保藏的目的；小量分装保存可减少菌种传代次数，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠；减少或避免杂菌污染，操作简便，易于推广，有利于提高生产效率和质量；总之，本专利技术提供的保存方法为微生物实验教学和科研单位的菌种保藏工作开展提供依据。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，在保存试剂中，甘油的浓度为20％～60％。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，甘油的浓度可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％等中的任一者或任意两者例如20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％或55％-60％之间的范围。具有合适浓度范围的甘油的保存试剂可以使得使用者在保存的过程快速、方便地选取保存试剂的体积与待保存的含目标菌的菌液进行合理搭配，控制甘油的终浓度。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度为10％～30％。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度为15％～25％。通过以适宜范围内的甘油浓度保藏菌种，一方面确保在能够实现降低在低温状态下因水分结冰对菌体造成的物理伤害的目的前提下，减少甘油的使用，缩小成本，另一方面，避免甘油浓度过大造成的目标菌保存液过于粘稠，影响其中菌体的性能恢复，再有，甘油浓度过低，不能有效地保存菌体免于在低温状态下因水分结冰造成的物理伤害。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度可以是10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％等中的任意一者或任意两者例如10％-14％、16-20％、22-26％或26％-30％等之间的范围。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，低温保存的温度为-80℃、-70℃或者-20℃。将目标菌保存液置于-80℃～-20℃低温条件保存，可以减缓菌体体内的酶活，降低其新陈代谢，延缓其衰老的时间，进而实现其长期保存的目的，且基因工程菌菌体仍然具有一个较高的活力；将目标菌保存液置于-80℃、-70℃或者-20℃条件下，其保存效果更好。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，转基因工程菌为大肠杆菌。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，大肠杆菌为大肠杆菌TOP10细胞、DH5α细胞和BL21(DE3)细胞中的任意一种。大肠杆菌作用基因工程技术中常用的宿主菌，其具有生长速度快，培养条件简单，易于传代等特点，这些特点为深入研究猪戊型肝炎病毒基因的功能提供了便利。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，其将转猪戊型肝炎病毒基因工程菌保存于含有甘油的生理盐水的保存试剂中，在分装于已灭菌的EP管中，并立即置于-80℃～-20℃条件下进行低温保存；该保存方法采用甘油-生理盐水保存法，小量分装保存可减少菌种传代次数，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠，减少或避免杂菌污染；该保存方法具有操作简便，易于推广，有利于提高生产效率和质量等特点，为微生物实验教学和科研单位的菌种保藏工作开展提供依据。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同时间后的工程菌的PCR鉴定结果图；图2为本专利技术试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同时间后的工程菌的菌落形态照片；图3为本专利技术试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同6个月后生物学特性(靛基质试验、VP试验、MR试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；图4为本专利技术试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同9个月后生物学特性(靛基质试验、VP试验、MR试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；图5为本专利技术试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同12个月后生物学特性(靛基质试验、VP试验、MR试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；图6为本专利技术试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同18个月后生物学特性(靛基质试验、VP试验、MR试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；图7为本专利技术试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同24个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，其特征在于，其包括：将保存试剂加入至含目标菌的菌液中，得到目标菌保存液；将所述目标菌保存液分装于已灭菌的EP管中，并立即置于‑80℃～‑20℃条件下进行低温保存；其中，所述目标菌为转化有外源质粒的转基因工程菌，所述外源质粒含有猪戊型肝炎病毒基因序列；所述保存试剂为含有甘油的生理盐水。

【技术特征摘要】
1.一种转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，其特征在于，其包括：将保存试剂加入至含目标菌的菌液中，得到目标菌保存液；将所述目标菌保存液分装于已灭菌的EP管中，并立即置于-80℃～-20℃条件下进行低温保存；其中，所述目标菌为转化有外源质粒的转基因工程菌，所述外源质粒含有猪戊型肝炎病毒基因序列；所述保存试剂为含有甘油的生理盐水。2.根据权利要求1所述的转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，其特征在于，在所述保存试剂中，甘油的浓度为20％～60％。3.根据权利要求2所述的转猪戊型肝炎病毒基因工程菌的保存方法，其特征在于，在所述目标菌保存液中，甘油的浓度为10％～30％。4.根据权利要求3所述的转猪戊型肝炎病...

【专利技术属性】
技术研发人员：余美伦，孟庆雪，秦香芹，李影，韩伟丽，何佳，王春东，苑玉凤，李海英，王宁，梅潇潇，
申请(专利权)人：哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23