寇氏隐甲藻的低温保存方法技术

本发明专利技术公开了一种寇氏隐甲藻的低温保存方法，包括以下步骤将寇氏隐甲藻活化和培养后获得的藻细胞加入培养基中，获得藻细胞藻细胞培养液；将冻存保护液与藻细胞培养液混合生成保种液后分装于冻存管中，冻存管进行预冻降温处理，降至‑40±1℃后，放入低温冰箱或液氮罐中保存。本发明专利技术解决了寇氏隐甲藻低温液体保存过程中存活率低、藻种难以复苏及复苏后细胞活力低、发酵产量降低等技术难题。该方法操作简单、方便，成本低廉，适用于以寇氏隐甲藻为材料的科研和生产开发活动中藻种的保存。

Cryopreservation of C. cohnii.

【技术实现步骤摘要】
寇氏隐甲藻的低温保存方法
本专利技术涉及微藻生物
，更具体涉及到一种寇氏隐甲藻的低温保存方法。
技术介绍
寇氏隐甲藻是一种海洋双鞭毛甲藻，可通过人工发酵培养，利用有机碳、氮源合成并积累二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)。DHA俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的不饱和脂肪酸，属于ω-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50％，因此，对婴幼儿智力和视力发育至关重要，同时对成年人健康的维持也起着非常重要的作用，因而在水产养殖、动物饲料、食品、药品等行业中有广泛的用途。由于寇氏隐甲藻细胞油脂中富含DHA，而其他多不饱和脂肪酸含量较少，是生产人体所需DHA的良好来源。但与其他富含人体必需多不饱和脂肪酸的海洋真菌，如裂殖壶菌相比，目前利用隐甲藻发酵生产DHA的生产实践并不多见，其主要原因除了隐甲藻对培养条件要求较高，产量相对较低之外，藻种的保存及活力的维持也是制约隐甲藻产业化开发的瓶颈问题之一。国内外对寇氏隐甲藻积累DHA及其发酵条件和破壁方法有了较多研究，而对其有效的保存方法和操作则鲜有报道。目前微藻的保藏方法有继代培养法、固定化保存法、浓缩低温保存法、冷冻干燥法等。隐甲藻细胞在合适的培养条件下可大量积累脂肪酸油脂，且营养细胞具有游动性，保种时保护剂的使用或保存条件不当时，极易引起细胞受损，导致破裂和油脂外溢，造成存活率低和复苏后细胞活力降低，丧失游动性，并最终导致生长缓慢、生物量低，使研究工作和生产活动无法正常进行。因此，目前隐甲藻保种一般多采用固定化传代保存法，即将藻细胞接种于固体平板或斜面培养基上，待有明显菌落生长后，置于室温或4℃冰箱中保存，1-3个月传代一次。该方法需要定期传代，操作繁琐、工作量大，且极易污染和导致藻种性状退化等。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种寇氏隐甲藻的低温保存方法。本专利技术的技术方案如下：一种寇氏隐甲藻的低温保存方法，包括以下步骤S1将寇氏隐甲藻活化和培养后获得的藻细胞加入到灭菌的锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降10-30min，用移液枪吸取去掉上清液，向收集到的藻细胞中加入培养基，轻摇使藻细胞悬浮并混合均匀，并调整培养基用量，获得藻细胞密度约为2×107个/ml的藻细胞培养液；S2将灭菌的甘油与稀释液Dsolution按照体积比6:4的比例混合，配制成冻存保护液；S3按照体积比为(0.8-1.2):1的比例将步骤S2中冻存保护液与步骤S1中藻细胞培养液混合生成保种液，充分摇匀后，按1.0-2.0ml/管分装于冻存管中，密封并做好标记；S4将步骤S3标记好的冻存管进行预冻降温处理，降至-40±1℃后，放入低温冰箱或液氮罐中保存。优选地，步骤S2中稀释液Dsolution的配方为：每100ml含NaCl1.5-2.0g，MgSO40.1-0.5g，CaCl2·2H2O0.01-0.05g，KCl0.05-0.1g，(NH4)2SO40.01-0.05g，乙酸钠0.1-0.5g，Tris0.0.5-0.1g。优选地，步骤S4中预冻降温程序为：4℃冷冻15-30min，-20℃冷冻50-70min，-40℃冷冻50-70min。优选地，步骤S1中寇氏隐甲藻的活化和培养包括以下步骤：S1.1从斜面或平板培养物中用接种环挑取单藻落，接种于10ml已灭菌的培养基中，25±1℃,150rpm摇床中振荡培养48-96小时；S1.2无菌条件下取样进行显微镜观察，选择细胞游动性好、大小均匀且胞内油滴积累明显的培养物，按照5-10％的接种量转接到50ml已灭菌的培养基中,25±1℃,150rpm摇床中振荡培养24-72小时，得二代培养物藻细胞；S1.3重复步骤S1.2,获得三代培养物藻细胞。优选地，步骤S3中保种液中甘油的终浓度为30％。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术解决了寇氏隐甲藻低温液体保存过程中存活率低、藻种难以复苏及复苏后细胞活力低、发酵产量降低等技术难题。该方法操作简单、方便，成本低廉，适用于以寇氏隐甲藻为材料的科研和生产开发活动中藻种的保存。2)本专利技术利用一定浓度甘油作保护剂，采用特定的降温流程的超低温保存方法，可以维持较高的存活率，复苏后细胞活力高，发酵生物量高，同时该方法便于长期保存、减少传代次数，因而降低杂菌污染和藻种退化几率。3)可以保持较高的存活率和细胞活力，便于开展以寇氏隐甲藻为材料的实验研究工作和生产开发活动下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步描述。附图说明图1为寇氏隐甲藻保存种正交实验条件表；图2为各因素与冻存复苏后细胞密度的关系图；图3为本专利技术方法与常规方法对菌种AT30772的保存效果比较；图4为各实验组冻存后细胞发酵能力测试结果示意图。具体实施方式为了更充分理解本专利技术的
技术实现思路
，下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案进一步介绍和说明。以下通过具体实施例1和2，以寇氏隐甲藻ATCC30772为例，对本专利技术的一种寇氏隐甲藻的低温保存方法进行说明。实验设计：选择降温速率、保护剂浓度和保存盐缓冲液盐度为因子，各取3个水平进行L9(34)正交试验，见图1。降温速率(A)表示藻种分别在4℃、-20℃和-40℃预冻时间，其中3个水平分别为A1(10min，30min，2h)、A2(20min，1h，1h)、A3(30min，2h，30min)；保护剂甘油终浓度(B)3个水平分别为B1(7.5％)、B2(15％)、B3(30％)；保存盐缓冲液(C)通过采用不同盐缓冲液改变冻存保护液盐度和缓冲范围，3个水平分别为C1(100％Dsolution)、C2(生理盐水：Dsolution＝1:1)、C3(100％生理盐水)。冻存保护液含保护剂甘油和保存盐缓冲液。实施例1：寇氏隐甲藻ATCC30772的低温保存。1)在无菌操作台中，从生长良好的寇氏隐甲藻ATCC30772平板培养物中用接种环挑取单藻落，接种于10ml新鲜灭菌的液体培养基中，轻摇使藻落松散开，置于25±1℃,转速为150rpm的摇床中振荡培养72小时；2)观察上述步骤中的培养物，待其浊度变大，培养基颜色由棕黄色逐渐变浅后，在无菌条件下取样在显微镜下进行镜检，确定无杂菌污染后，选择细胞游动性好、大小均匀且胞内油滴积累明显的培养物，按照5％的接种量转接到250ml培养瓶中，内装50ml新鲜灭菌的液体培养基，继续按上述“置于25±1℃,转速为150rpm的摇床中振荡培养72小时”的条件培养48小时，此为二代培养物藻细胞；并重复此步骤获得三代培养物藻细胞；3)培养结束后，将获得的三代培养物藻细胞转到已灭菌的50ml锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降约30min，待藻细胞沉降堆积至离心管锥底部，用移液枪小心吸取上清液，弃去，尽量吸完全。然后向收集到的藻细胞中加入新鲜培养基，轻摇使悬浮并混合均匀。取少量混合物在显微镜下计数，并根据计数结果用新鲜培养基调整密度，使藻细胞培养液中藻细胞密度达到约2×107个/ml；4)按照实验设计方案，将制备好的藻细胞培养液与冻存保护液按照1:1(体积比)的比例混合形成保种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寇氏隐甲藻的低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤S1将寇氏隐甲藻活化和培养后获得的藻细胞加入到灭菌的锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降10‑30min，用移液枪吸取去掉上清液，向收集到的藻细胞中加入培养基，轻摇使藻细胞悬浮并混合均匀，并调整培养基用量，获得藻细胞密度约为2×10

【技术特征摘要】
1.一种寇氏隐甲藻的低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤S1将寇氏隐甲藻活化和培养后获得的藻细胞加入到灭菌的锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降10-30min，用移液枪吸取去掉上清液，向收集到的藻细胞中加入培养基，轻摇使藻细胞悬浮并混合均匀，并调整培养基用量，获得藻细胞密度约为2×107个/ml的藻细胞培养液；S2将灭菌的甘油与稀释液Dsolution按照体积比为6:4的比例混合，配制成冻存保护液；S3按照体积比为(0.8-1.2):1的比例将步骤S2中冻存保护液与步骤S1中藻细胞培养液混合制成保种液，充分摇匀后，按1.0-2.0ml/管分装于冻存管中，密封并做好标记；S4将步骤S3标记好的冻存管进行预冻降温处理，降至-40±1℃后，放入低温冰箱或液氮罐中保存。2.根据权利要求1所述寇氏隐甲藻的低温保存方法，其特征在于，步骤S2中稀释液Dsolution的配方为：每100ml含NaCl1.5-2.0g，MgSO40.1-0.5g，CaCl2·2H2O0.01...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永梅，陈伟，刘鑫，陈晶，张旭，
申请(专利权)人：武汉大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44