一种样品总微生物及其总DNA的保护剂及保藏方法技术

本发明专利技术公开了一种样品总微生物及其总DNA的保护剂及保藏方法。样品总微生物及其总DNA的保护剂包括甘油、蔗糖、谷氨酸钠、聚乙二醇、EDTA二钠盐、柠檬酸钠、水和液体石蜡。所述样品总微生物及其总DNA的保藏方法包括以下步骤：将样品液加至滤膜膜面上进行抽滤，取下滤膜，以含样品的膜面为内膜面，将所述滤膜对折，放置于无菌袋内，向所述无菌袋内注入样品总微生物及其总DNA的保护剂至浸润透整张所述滤膜，排出空气后封口，冷冻保藏。本发明专利技术能够对现场采集的大量的微生物菌群样品进行快速简单地微缩处理，使样品便于保存和运输，能有效提高样品总微生物的存活率，有效防止总DNA降解，完整保存微生物的总DNA信息，操作简单，方便保藏。

【技术实现步骤摘要】
一种样品总微生物及其总DNA的保护剂及保藏方法
本专利技术涉及微生物保藏领域，具体涉及一种样品总微生物及其总DNA的保护剂及保藏方法。
技术介绍
以往在进行生态环境微生物群落调查中，限于当时的分析技术和条件，往往在项目结束后，对所采集的样品没有加以重视和保留，这些样品包含了环境样品总微生物及其总DNA，是对采样点的微生物菌群信息最完整的记录，具有特殊性、唯一性和不可复制性。由于受技术的限制不能在现场对样品进行实时快速微缩处理，而采集到的样品往往所占体积较大，不易储存和运输，且在运输过程中随着运输时间的增加，样品中的微生物会发生变化甚至发生交叉污染，导致采集数据发生偏差。随着分子生物学技术的快速发展，特别是基因组DNA测序分析方法的日益成熟完善，为环境微生物及其与环境因子之间的关系研究提供了有力的检测分析手段。若能有效地保存样品微生物的DNA，可用先进的分析方法对过去的实验结果进行比较和完善；或对某个区域内不同时期的环境样品进行比较，分析其变化，特别是与环境因素变化之间存在的关系。而且特定的时间、特定的气候、特定的理化条件和特定的生物环境，造就了特定的微生物群落结构和生物功能，因此，对于各时期采集到的样品总微生物及总DNA进行保藏，使其能够长时间的维持活性，可以保留各时期的微生物群落信息和基因库，其中包括可供利用和改造的功能基因片段和素材，具有非常重要的意义。目前，我国有关样品总微生物及其总DNA的保藏方法还未有具体的记载。中国专利文献CN102994388B公开了一种菌种保藏液和菌种保藏方法。该菌种保藏液以100mL溶液计含有酵母粉1.2g-0.6g、氯化钠0.4g-1.0g、二甲亚砜2mL-10mL、甘油10mL-30mL、其余为水。该菌种保藏方法是将待保藏菌种加入上述菌种保藏液中，混合均匀，得到待保藏菌液。用无菌滤纸吸取待保藏菌液，得到无菌滤纸；用无菌透明胶带将含菌滤纸固定在无菌蜡纸上，然后置于冰箱中保藏。该保藏方法主要针对于已富集的菌种保藏，对于微生物的DNA的保存性能较低，不能长时间的维持微生物DNA的活性，且上述方法利用无菌滤纸吸取的方式仅适用于单一菌种保藏，不适用于多种微生物及其总DNA保藏。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中不能快速有效地保藏环境样品中的样品总微生物及其总DNA，从而提供一种保存期长、保存效果好的样品总微生物及其总DNA的保护剂及保藏方法。为此，本专利技术提供了一种样品总微生物及其总DNA的保护剂，包括如下重量份的原料：甘油15-25重量份，蔗糖8-12重量份，谷氨酸钠5-9重量份，聚乙二醇0.5-2重量份，EDTA二钠盐0.1-0.5重量份，柠檬酸钠3-7重量份、水56-60重量份和液体石蜡50-150重量份。所述的样品总微生物及其总DNA的保护剂，包括如下重量份的原料：甘油20重量份，蔗糖10重量份，谷氨酸钠7重量份，聚乙二醇1重量份，EDTA二钠盐0.37重量份，柠檬酸钠5重量份、水56.63重量份和液体石蜡100重量份。本专利技术提供了一种样品总微生物及其总DNA的保藏方法，包括以下步骤：(1)将样品液加至滤膜膜面上进行抽滤，取下滤膜，以含样品的膜面为内膜面，将所述滤膜对折，然后放置于无菌袋内；(2)向所述无菌袋内注入所述的样品总微生物及其总DNA的保护剂至浸润透整张所述滤膜，然后将所述无菌袋内空气排出并封口，冷冻保藏。所述的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，所述滤膜为混合纤维素膜或硝酸纤维素膜。所述的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，所述滤膜的孔径为0.22μm～0.45μm。所述的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，所述冷冻保藏的温度为-18～-70℃。所述的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，所述无菌袋为由聚乙烯制成的。优选地，所述无菌袋为高压聚乙烯(LDPE)或线性低密度聚乙烯(LLDPE)制成的。所述的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，所述无菌袋为自封袋。所述的样品总微生物及其总DNA的保护剂在微生物或DNA保存中的用途。本专利技术的技术方案具有如下优点：1、本专利技术提供的一种样品总微生物及其总DNA的保护剂，包括如下重量份的原料：甘油15-25重量份，蔗糖8-12重量份，谷氨酸钠5-9重量份，聚乙二醇0.5-2重量份，EDTA二钠盐0.1-0.5重量份，柠檬酸钠3-7重量份、水56-60重量份和液体石蜡50-150重量份；所述样品总微生物及其总DNA的保护剂中的EDTA二钠盐和柠檬酸钠可螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+，从而抑制DNA酶活性，防止微生物DNA降解。同时，所述样品总微生物及其总DNA的保护剂中的甘油可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型，以防止因冷冻保藏对细胞的损害，蔗糖和谷氨酸钠为微生物提供能量，可长时间维持微生物活力，从而使该样品总微生物及其总DNA的保护剂既能防止微生物的DNA降解，同时也可以提高保藏微生物的存活率，进而可以长时间的维持样品总微生物及其总DNA的完整性。2、本专利技术提供的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，包括以下步骤：(1)将样品液加至滤膜膜面上进行抽滤，取下滤膜，以含样品的膜面为内膜面，将所述滤膜对折，然后放置于无菌袋内；(2)向所述无菌袋内注入所述的样品总微生物及其总DNA的保护剂至浸润透整张所述滤膜，然后将所述无菌袋内空气排出并封口，冷冻保藏。先将样品液加至滤膜上进行抽滤，使得滤膜膜面上可截留样品液中绝大多数的微生物，将含微生物的滤膜对折后放入无菌自封袋中，然后向袋内加所述的样品总微生物及其总DNA的保护剂至浸润透所述滤膜，样品总微生物及其总DNA的保护剂形成保护剂层，从而提高滤膜上微生物的存活率，避免微生物的DNA降解，延长保藏时间；将无菌袋内空气排出后封口，使其内部形成真空，保证无菌袋内为无氧状态，提高了微生物的保存效能，延长了样品总微生物及其总DNA的保藏时间，操作简单，适用于环境样品样品总微生物及其总DNA的保藏及转运。3、本专利技术提供的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，能够对现场采集的大量的微生物菌群样品，尤其是水体样品，进行快速简单地微缩处理，采集完成后即可进行保藏处理，使样品便于保存和运输，避免样品采集及运顺过程中随着时间的增加，样品中的微生物会由于外界环境变化而变化甚至发生交叉污染，避免采集数据发生偏差，能有效提高微生物的保藏存活率，有效防止微生物的DNA降解，完整保存微生物的总DNA信息，操作简单，节省空间，方便保藏。4、采用本专利技术提供的样品总微生物及其总DNA的保藏方法，-18℃～-70℃冷冻保藏3年后微生物存活率在80％以上，微生物的DNA保存完整，未发生降解现象。附图说明图1是实施例13的DNA电泳图谱；图2是对比例9的DNA电泳图谱；图3是对比例10的DNA电泳图谱；图4是对比例11的DNA电泳图谱。具体实施方式实施例1本实施例提供一种样品总微生物及其总DNA的保护剂，包括如下原料：甘油15g，蔗糖12g，谷氨酸钠9g，聚乙二醇2g，EDTA二钠盐0.5g，柠檬酸钠7g，水60g和液体石蜡150g。按照上述的样品总微生物及其总DNA的保护剂的组方进行称取原料，然后将称取的原料混合在一起，调匀，即得。实施例2本实施例提供一种样品总微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种样品总微生物及其总DNA的保护剂，其特征在于，包括如下重量份的原料：甘油15‑25重量份，蔗糖8‑12重量份，谷氨酸钠5‑9重量份，聚乙二醇0.5‑2重量份，EDTA二钠盐0.1‑0.5重量份，柠檬酸钠3‑7重量份、水56‑60重量份和液体石蜡50‑150重量份。

【技术特征摘要】
1.一种样品总微生物及其总DNA的保护剂，其特征在于，包括如下重量份的原料：甘油15-25重量份，蔗糖8-12重量份，谷氨酸钠5-9重量份，聚乙二醇0.5-2重量份，EDTA二钠盐0.1-0.5重量份，柠檬酸钠3-7重量份、水56-60重量份和液体石蜡50-150重量份。2.根据权利要求1所述的样品总微生物及其总DNA的保护剂，其特征在于，包括如下重量份的原料：甘油20重量份，蔗糖10重量份，谷氨酸钠7重量份，聚乙二醇1重量份，EDTA二钠盐0.37重量份，柠檬酸钠5重量份、水56.63重量份和液体石蜡100重量份。3.一种样品总微生物及其总DNA的保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将样品液加至滤膜膜面上进行抽滤，取下滤膜，以含样品的膜面为内膜面，将所述滤膜对折，然后放置于无菌袋内；(2)向所述无菌袋内注入权利要求1-2任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂祖新，郑国华，贺伟华，张莉莉，刘卓荣，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36