一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏及复壮的方法技术

一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏及复壮的方法，属于含氮废水生物处理技术领域。将待保藏的厌氧氨氧化菌混培物取出，加入磷酸盐缓冲溶液、混匀，离心去除上清液，得到厌氧氨氧化菌沉淀物；将沉淀物与二甲基亚砜混合，得到的混合物置于‑20℃中预冻；将冷冻混合物置于真空冷冻干燥机中，在温度‑92℃、真空度5Pa下冷冻干燥以得到厌氧氨氧化菌干粉菌剂；将得到的干粉菌剂真空密封，置于4℃下避光长期保藏。复壮前干菌粉需要在4℃厌氧氨氧化菌培养液中进行24h的细胞补水过程；菌体自溶期结束后，向反应器中投加反应器体积1％的厌氧氨氧化混培物以加快复壮过程，复壮后的厌氧氨氧化菌的活性恢复率较高且具有较高的脱氮能力。

The method of vacuum freeze drying preservation and rejuvenation of a kind of anaerobic ammonia oxidation bacteria

【技术实现步骤摘要】
一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏及复壮的方法
本专利技术公开了一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏及复壮的方法，属于含氮废水生物处理
，特别涉及能够保持厌氧氨氧化菌活性的长期保藏方法并将保藏厌氧氨氧化菌作为种泥投加的迅速活性恢复方法。
技术介绍
厌氧氨氧化(anammox)作为一种新型生物脱氮工艺，以NH4+-N为电子供体，NO2--N为电子受体[1]，[1].Strous,M.,J.G.KuenenandM.S.Jetten,Keyphysiologyofanaerobicammoniumoxidation.ApplEnvironMicrobiol,1999.65(7):p.3248-50.并产生氮气，可实现两种氮素污染物的同时去除[2]。[2].vandeGraaf,A.A.,etal.,Anaerobicoxidationofammoniumisabiologicallymediatedprocess.ApplEnvironMicrobiol,1995.61(4):p.1246-51.由于anammox不需氧气与有机物参与反应，无需曝气和外加有机碳源，能耗低于传统的生物脱氮工艺。被认为是目前最经济的生物脱氮工艺之一，其应用前景广阔。但是厌氧氨氧化菌生长缓慢，倍增时间长达14天，导致厌氧氨氧化工艺难以启动。近年来有研究表明，增大前期接种量或增加后期菌种流加频率可解决anammox的启动缓慢的问题[3]。[3].唐崇俭等,基于基质浓度的厌氧氨氧化工艺运行策略.化工学报,2009.60(3):第718-725页.但是这两种方法需要大量的优质的厌氧氨氧化菌作为种泥，因此能够保持厌氧氨氧化菌活性的保藏方法以及保藏的厌氧氨氧化菌作为种泥投加后活性迅速恢复的复壮方法是一个值得研究的课题。菌种保藏技术是通过人为创造一个干燥、低温、缺氧的环境，通过添加适当保护剂，抑制微生物的代谢，经长期保藏后保持菌种一定的存活率，保证菌种活性较快恢复。微生物保存方法主要有两种：第一种为常规保存法，包括半固体穿刺、石蜡等方法；第二种为添加保护剂低温保存，包括冷冻法、冷冻干燥法等。目前厌氧氨氧化菌的保存方法多为-200℃液氮冷冻干燥法、-20℃～-80℃的冷冻法，这些方法存在诸如不安全、能耗较高且菌种活性恢复较差；4℃冷藏法也有众多研究，但是其保藏的时间较短，通常用于实验室规模的短期保存。而采用真空冷冻干燥法具有保藏期长，存活率高,变异率低等特点，是目前厌氧菌常用的一种保藏方法。但是并无厌氧氨氧化菌利用真空冷冻干燥法保藏的相关报道。厌氧氨氧化菌对环境条件敏感决定了需要寻求一种长远高效的保藏方法。在进行干法保藏时，需考虑保护剂选择、保护剂添加比例、保藏时间及活性恢复措施对厌氧氨氧化菌保藏效果的影响。
技术实现思路
本专利技术针对目前厌氧氨氧化保藏技术的不足，提出了一种采用真空冷冻干燥法进行厌氧氨氧化菌干法长期保藏以及保藏菌种复壮过程优化方法。真空冷冻干燥保藏方法操作简便、保藏期长、获得菌粉降低了运输和储藏成本，优化后的复壮方法使菌种活性恢复速度快、活性恢复程度较高，能实现较高的脱氮性能。因此该专利能够实现厌氧氨氧化菌长期保藏及工业化应用的目标。本专利技术的技术方案：一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏方法，步骤如下：(1)对待保藏的厌氧氨氧化混培物，在6000rpm条件下离心10min后，弃置上清液；再加入0.2M磷酸盐缓冲溶液、混匀，离心去除上清液，重复多次，得到厌氧氨氧化菌沉淀物；(2)将步骤(1)得到的厌氧氨氧化菌沉淀物置于经灭菌处理后的培养皿中，再向培养皿中加入二甲基亚砜，混匀，混合过程进行氮气吹扫；其中，二甲基亚砜的添加量为混合物总质量的3％；(3)将步骤(2)得到的混合物置于-20℃条件下预冻；(4)将上述装有待保藏菌体的表面皿置于真空冷冻干燥机中，在温度-92℃、真空度5Pa条件下，冷冻干燥，得到干菌粉；(5)将步骤(4)获得的干菌粉转移真空袋后，经真空密封后放入4℃避光保藏。一种优化的保藏菌种复壮方法，步骤如下：(1)保藏期结束后，向干菌粉加入0.2MPBS，混匀，离心去除上清液，重复多次，得到厌氧氨氧化沉淀物；向厌氧氨氧化沉淀物中加入基质溶液，曝氮气脱氧后放入4℃冰箱中使细胞补水24h；(2)补水后弃置上清液，再次离心清洗，将所得厌氧氨氧化沉淀物转移至复壮反应器，对复壮反应器曝氮气后开始复壮过程；(3)在复壮过程的菌体自溶期结束后；向复壮反应器中加入复壮反应器的容积分数1％的厌氧氨氧化污泥混培物以加快复壮过程；以上步骤的混合过程在避光和无氧条件下进行。本专利技术的有益效果：1.采用真空冷冻干燥法获得厌氧氨氧化干菌粉呈砖红色，其体积与质量大大降低，这便于储藏和运输，长期保藏后形态未见明显变化。2.在保藏期结束时，通过采用优化后的菌种复壮方法可在较短时间内出现厌氧氨氧化反应，复壮结果说明菌种活性恢复率高，可在较高的氮负荷条件下达到很高的脱氮性能；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的突出特点和显著进步作进一步阐明，仅在于说明本专利技术而决不局限于以下实例。采用本专利技术制备厌氧氨氧化菌干粉菌剂并对其复壮效果进行测试。实施例1：厌氧氨氧化干菌粉的制备制备条件：首先取适量待保藏的厌氧氨氧化混培物，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗并离心，重复三次，得到厌氧氨氧化菌沉淀物；取6g沉淀物置于灭菌后的培养皿中并向沉淀物中加入二甲基亚砜(二甲基亚砜的添加量为混合物总质量的3％)，混匀；将培养皿置于-20℃冰箱中预冻24；完成预冻后将所得冷冻混合物置于真空冷冻干燥机中，在在温度-92℃，真空度5Pa下冷冻干燥24h；冻干完成后，将获得的干菌粉放入真空袋中进行真空密封、4℃避光保藏60天。所得的干菌粉的体积、质量较低，颜色呈砖红色。实施例2：保藏菌种复壮活性测试复壮活性测试中反应器的基质溶液中NH4+-N和NO2--N浓度比为1:1.32,初始溶液中NH4+-N为50mg/L。之后根据复壮情况逐步提高基质溶液中NH4+-N和NO2--N浓度。测试条件：将实施例1中保藏完成菌粉启封置于离心管中并加入PBS溶液，清洗并离心，重复三次，得到厌氧氨氧化沉淀物。向沉淀物中加入基质溶液，之后放入4℃冰箱中以使细胞补水24h；补水完成后再次清洗离心厌氧氨氧化沉淀物，将沉淀物转移至100ml模拟反应器(由血清瓶和针头组成SBR)中后加入基质溶液，反应器在恒温、密闭、遮光摇床(170r/min,35℃)条件下运行，水力停留时间48h，每次更换基质溶液需用氮气吹脱反应器内空气。之后开始复壮过程。复壮初期反应器出水有机物浓度与NH4+-N浓度高于进水，这是由于在菌粉制备与保藏期间有部分菌体死亡。在菌体自溶期结束后(反应器出水COD浓度较低时)向反应器内加入1ml厌氧氨氧化污泥混培物，之后发现反应器出现了NH4+-N、NO2--N的同步显著去除和少量NO3--N的同时产生，之后提高反应器的氮负荷。在复壮末期反应器总氮负荷和去除率较高且运行稳定，平均比厌氧氨氧化活性(SAA)为115.84mg-N/gVSS/d，而保藏前厌氧氨氧化混培物在同样条件下的SAA为130mg-N/gVSS/d，菌种活性恢复率89％，且氨氮与亚硝酸盐去除的化学计量比与理论值接近，即反应器中厌氧氨氧化为主导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏方法，其特征在于，步骤如下：(1)对待保藏的厌氧氨氧化混培物，在6000rpm条件下离心10min后，弃置上清液；再加入0.2M磷酸盐缓冲溶液、混匀，离心去除上清液，重复多次，得到厌氧氨氧化菌沉淀物；(2)将步骤(1)得到的厌氧氨氧化菌沉淀物置于经灭菌处理后的培养皿中，再向培养皿中加入二甲基亚砜，混匀，混合过程进行氮气吹扫；其中，二甲基亚砜的添加量为混合物总质量的3％；(3)将步骤(2)得到的混合物置于‑20℃条件下预冻；(4)将上述装有待保藏菌体的表面皿置于真空冷冻干燥机中，在温度‑92℃、真空度5Pa条件下，冷冻干燥，得到干菌粉；(5)将步骤(4)获得的干菌粉转移真空袋后，经真空密封后放入4℃避光保藏。

【技术特征摘要】
1.一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏方法，其特征在于，步骤如下：(1)对待保藏的厌氧氨氧化混培物，在6000rpm条件下离心10min后，弃置上清液；再加入0.2M磷酸盐缓冲溶液、混匀，离心去除上清液，重复多次，得到厌氧氨氧化菌沉淀物；(2)将步骤(1)得到的厌氧氨氧化菌沉淀物置于经灭菌处理后的培养皿中，再向培养皿中加入二甲基亚砜，混匀，混合过程进行氮气吹扫；其中，二甲基亚砜的添加量为混合物总质量的3％；(3)将步骤(2)得到的混合物置于-20℃条件下预冻；(4)将上述装有待保藏菌体的表面皿置于真空冷冻干燥机中，在温度-92℃、真空度5Pa条件下，冷冻干燥，得到干菌粉；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张捍民，张帆，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21