一种丛枝菌根真菌的保藏方法技术

本发明专利技术提供了一种丛枝菌根真菌的保藏方法，属于微生物保藏技术领域。其的在于解决现有技术费时、费力、需要较大的空间和温室条件或操作步骤繁琐，成本较高等问题。本发明专利技术方法，包括以下步骤：1)采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子，消毒后制得丛枝菌根真菌孢子悬浮液；2)以海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇作为载体，将上述孢子悬浮液包埋到载体中得到菌剂混合物；3)将菌剂混合物通过物理挤压方式滴入无菌交联剂中制成球状物，固化清洗后得到丛枝菌根真菌包埋小珠；4)将包埋小珠干燥后装入离心管，放置在4℃冰箱中保藏。本发明专利技术方法操作简单，成本低廉，不需要占用大量空间，节省物力和人力。

A method of preservation of arbuscular mycorrhizal fungi

The invention provides a method for preservation of the arbuscular mycorrhizal fungi, which belongs to the technical field of microbial preservation. The problem is to solve the problem that the existing technology is time-consuming, laborious, the need is larger, the conditions of the greenhouse or the operation steps are tedious and the cost is high. The method of the invention comprises the following steps: 1) by wet sieve decantation and sucrose centrifugation isolated arbuscular mycorrhizal fungi spores from pot propagation agents, prepared after disinfection of arbuscular mycorrhizal fungal spore suspension; 2) with sodium alginate, carrageenan, gelatin and polyvinyl alcohol as the carrier, the spore suspension embedded into the carrier obtained in agent mixture; 3) the agent mixture through physical pressure dropped into a ball made of bacteria crosslinking agent, arbuscular mycorrhizal fungi entrapped beads has been cured after cleaning; 4) the immobilized beads after drying into the centrifuge tube, placed in the refrigerator preservation 4 C. The invention has the advantages of simple operation, low cost, no need to occupy a large amount of space, and save material and manpower.

【技术实现步骤摘要】
一种丛枝菌根真菌的保藏方法
本专利技术涉及微生物领域方面，具体涉及一种丛枝菌根真菌的保藏方法。
技术介绍
丛枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizalfungi，AMF)是一类能与地球上80％的植物根系形成共生体的菌根真菌，对植物的生长发育具有重要作用。菌种保藏是微生物学及相关学科研究的基础，其目的是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于未来持久的研究和应用，故菌种保藏也是AMF研究中的一项重要的内容。然而由于AMF特殊的生物特性―不能纯培养，只能与植物根系共生后才能完成生活史。因此，世界各国的AMF的资源收集与保藏机构都是和普通微生物菌种库分开，而独立建成的。目前AMF保藏方法主要有寄主传代保藏法、低温保藏法和超低温保藏法。寄主传代保藏法包括盆栽传代保藏法和离体根器官传代保藏法，盆栽传代保藏法能始终长久保持AMF菌种的高生活力和新鲜度，但该法比较费时、费力、需要较大的空间和温室条件，并且还存在杂菌污染的风险；离体根器官传代保藏法主要是利用双重培养技术对AMF进行传代保藏，该法保藏的菌剂纯度较高，但对保藏条件和操作者的技术要求较高，故不能被多数人使用。低温保藏法是将AMF菌剂放置在4℃冰箱中保藏，这种方法会占用大量空间，菌种活力下降较快，保藏效果不佳。超低温保藏法是将AMF繁殖体与冷冻保护剂结合，放置在液氮或-80℃冰箱中保藏，这种方法使菌剂保藏时间较长，但需要专门的设备，操作步骤繁琐，成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种丛枝菌根真菌的保藏方法，以解决现有技术费时、费力、需要较大的空间和温室条件或操作步骤繁琐，成本较高等问题。本专利技术采用如下技术方案：一种丛枝菌根真菌的保藏方法，包括以下步骤：(1)采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子，消毒后制得丛枝菌根真菌孢子悬浮液；(2)以海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇作为载体，灭菌后，将上述孢子悬浮液包埋到载体中得到菌剂混合物；(3)将所述菌剂混合物通过物理挤压方式滴入无菌交联剂中制成球状物，固化清洗后得到丛枝菌根真菌包埋小珠；(4)将丛枝菌根真菌包埋小珠置于干燥箱中干燥；(5)将干燥后的丛枝菌根真菌包埋小珠转移至10mL离心管中，放置于4℃冰箱中长期保藏。在步骤(1)中，丛枝菌根真菌孢子悬浮液通过以下步骤制备：A、以三叶草、万寿菊、玉米3种植物为寄主，将丛枝菌根真菌进行盆栽培养，3个月后收获地下部分，置于阴凉处自然风干，得到丛枝菌根真菌扩繁菌剂；B、采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子；C、将丛枝菌根真菌孢子消毒15min，用无菌水漂洗6～10次得到丛枝菌根真菌孢子悬浮液。优选地，在步骤(2)中，所述载体为海藻酸钠载体、明胶和海藻酸钠混合载体、卡拉胶和海藻酸钠混合载体、聚乙烯醇和海藻酸钠混合载体；海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇的质量浓度分别为1～2％、3～5％、2～3％和8～10％；所述灭菌操作是将载体在121℃，0.12MPa压力下蒸汽灭菌20min。优选地，在步骤(3)中，所述物理挤压方式为将所述菌剂混合物用移液枪挤压；包埋载体所用交联剂为氯化钙溶液；所用交联剂质量浓度为2～4％，进一步优选为3％；包埋小珠的固化时间为2～4h。优选地，在步骤(4)中，所述丛枝菌根真菌干燥温度为27℃，干燥时间为48h。优选地，所述的丛枝菌根真菌为摩西球囊霉。为了既能保持丛枝菌根真菌菌种原有的特性，同时也希望保藏方法简单易行，本专利技术提供一种丛枝菌根真菌的保藏方法，以海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇作为载体，将丛枝菌根真菌孢子悬浮液包埋到载体中得到菌剂混合物，将菌剂混合物通过物理挤压方式滴入交联剂中制成球状物，固化清洗后得到丛枝菌根真菌包埋小珠，干燥后，放置于4℃冰箱进行保藏。本专利技术提供的丛枝菌根真菌保藏方法，操作简单，成本低廉，与普通保藏方法相比，不需要占用大量空间，节省物力和人力。同时，本专利技术能够有效保存丛枝菌根真菌活性，丛枝菌根真菌包埋小珠可直接作为菌剂接种于寄主植物。附图说明图1为不同菌剂对番茄幼苗生长发育的影响；图2为不同菌剂对番茄光合特性的影响；图3为不同菌剂对番茄根系菌根侵染率的影响；图4为不同菌剂对黄瓜根系菌根侵染率的影响。具体实施方式本专利技术提供一种丛枝菌根真菌的保藏方法，包括以下步骤：(1)丛枝菌根真菌菌剂的制备在日光温室内对丛枝菌根真菌进行3个月的扩繁培养，收获地下部分作为丛枝菌根真菌菌剂。试验菌种为摩西球囊霉，以三叶草、万寿菊、玉米3种植物作为寄主，所用基质为沸石、浮石、蛭石和泥炭(体积比为3:3:3:1)，采用21cm×18cm的塑料盆作为试验容器。(2)丛枝菌根真菌孢子的分离和提取称取20g扩繁菌剂，加入500mL无菌水，用玻璃棒搅拌1min，依次通过3个土壤标准筛(孔径上层为0.8mm，中层为0.25mm，下层为0.055mm)，再用无菌水冲洗1min，将下层筛子的残余物转至50mL有50％的蔗糖溶液的离心管中，3000r/min，离心3～5min，离心管的上清液迅速倒入小筛子中，用洗瓶冲洗小筛子里的残留物至培养皿。(3)丛枝菌根真菌孢子的消毒配制5％氯胺T+0.04％链霉素+2滴Tween20混合消毒溶液15mL，处理15min后转移至小筛子中，用无菌水漂洗6～10次。用洗瓶冲洗小筛子里的残留物至50mL离心管中，加无菌水定容至30mL，孢子含量约100个/mL。(4)包埋载体的准备加热制备质量浓度为2％的海藻酸钠溶液100mL，质量浓度分别为3％的明胶和1％的海藻酸钠混合溶液100mL，质量浓度分别为2％的卡拉胶和1％的海藻酸钠混合溶液100mL，质量浓度分别为8％的聚乙烯醇和1％的海藻酸钠混合溶液100mL。在121℃，0.12MPa压力下蒸汽灭菌20min，冷却到30℃后加入30mL丛枝菌根真菌孢子悬浮液得到丛枝菌根真菌混合菌剂。(5)丛枝菌根真菌包埋小珠的制备用移液枪将混合菌剂匀速滴入质量浓度为2～4％的无菌氯化钙溶液中，用玻璃棒轻轻搅拌形成球状物。固化2～4h，用无菌水将包埋小珠表面冲洗干净后在27℃下干燥48h，得到丛枝菌根真菌包埋小珠。(6)将包埋小珠装入灭菌干燥后的10mL离心管，密封后放置在4℃冰箱中长期保藏。为了实现本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，现结合以下具体的实施例，对本专利技术做进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以解释专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1不同载体的菌剂在番茄上的应用效果以番茄为寄主，供试菌剂为摩西球囊霉，进行盆栽培养试验，检测不同载体的丛枝菌根真菌菌剂(在4℃下保藏1个月)的保藏效果。试验共设5个处理，CK：空白对照；T1：海藻酸钠(SA)包埋菌剂；T2：明胶包埋菌剂；T3：卡拉胶包埋菌剂；T4：聚乙烯醇(PVA)包埋菌剂。将番茄种子用10％的次氯酸钠溶液表面消毒5～10min后，于55℃水中浸种15min，再经常温水中浸泡4h后，置于28℃恒温培养箱中催芽。待种子萌发，选取饱满、发芽整齐一致的种子播种于50孔穴盘中。待播种25d后，将番茄幼苗移栽于直径为8cm的营养钵中，同时接种丛枝菌根真菌菌剂共同培养。实施例2不同菌剂对黄瓜幼苗生长的影响试验采用穴盘育苗技术，供试菌剂为摩西球囊霉，探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丛枝菌根真菌的保藏方法，其特征在于包括如下步骤：(1)采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子，消毒后制得丛枝菌根真菌孢子悬浮液；(2)以海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇作为载体，灭菌后，将所述孢子悬浮液包埋到载体中得到菌剂混合物；(3)将所述菌剂混合物通过物理挤压方式滴入无菌交联剂中制成球状物，固化清洗后得到丛枝菌根真菌包埋小珠；(4)将丛枝菌根真菌包埋小珠置于干燥箱中干燥；(5)将干燥后的丛枝菌根真菌包埋小珠转移至10mL离心管中，放置于4℃冰箱中长期保藏。

【技术特征摘要】
1.一种丛枝菌根真菌的保藏方法，其特征在于包括如下步骤：(1)采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子，消毒后制得丛枝菌根真菌孢子悬浮液；(2)以海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇作为载体，灭菌后，将所述孢子悬浮液包埋到载体中得到菌剂混合物；(3)将所述菌剂混合物通过物理挤压方式滴入无菌交联剂中制成球状物，固化清洗后得到丛枝菌根真菌包埋小珠；(4)将丛枝菌根真菌包埋小珠置于干燥箱中干燥；(5)将干燥后的丛枝菌根真菌包埋小珠转移至10mL离心管中，放置于4℃冰箱中长期保藏。2.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌保藏方法，其特征在于步骤(1)中，丛枝菌根真菌孢子悬浮液通过以下步骤制备：A.以三叶草、万寿菊、玉米3种植物为寄主，将丛枝菌根真菌进行盆栽培养，3个月后收获地下部分，置于阴凉处自然风干，得到丛枝菌根真菌扩繁菌剂；B.采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子；C.将丛枝菌根真菌孢子消毒15min，用无菌水漂...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙锦，刘铭铭，薄宇，郭世荣，仇紫岩，孔镭，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32