检测髓过氧化物酶抑制剂的测定法制造技术

一种检测髓过氧化物酶抑制剂的测定法，该方法包括：在有所述髓过氧化物酶的可能抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢和氯化物源反应，产生次氯酸；使所有形成的次氯酸与适宜的胺反应，形成相应的氯胺；任选除去所有未反应的过氧化氢；在有碘化物存在的条件下，使所有形成的氯胺与适宜的检测分子反应，形成氧化的检测分子；通过在适宜的波长下测量吸光度或荧光而测定所形成的氧化检测分子的量；把引起所形成的氧化检测分子的量降低的那些化合物鉴定为髓过氧化物酶的抑制剂。还公开了髓过氧化物酶活性的诊断试验。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
抗微生物感染包括非特异性机理和由B淋巴细胞和T淋巴细胞介导的适应性免疫应答两个方面。非特异性机理，如酶的作用，pH值和上皮组织分泌物可防止很多微生物侵入。然而，当第一道防线被攻破时，吞噬细胞吞噬感染剂，并对它们进行处理，导致对B细胞和T细胞的刺激。吞噬系统缺陷，不论是先天的，还是获得性的，都会造成严重的后果，这是因为对正常个体而言，致病性较低的微生物会导致具有低效吞噬系统个体的复发性感染。多形核白细胞(PMNs)对于抗感染特别重要。这些细胞含有一种酶，即髓过氧化物酶，经证明具有很好的杀微生物作用。PMNs利用吞噬作用非特异性地吞噬微生物，把它们掺入到被称作吞噬体的液泡中，其与含有髓过氧化物酶的颗粒体融合，形成吞噬溶酶体。在吞噬溶酶体中，髓过氧化物酶的酶活性导致次氯酸，即一种有效的杀菌化合物(从过氧化氢和氯化物)的形成。次氯酸自身发生氧化，它们绝大部分与硫醇和硫醚剧烈反应，并且可把胺转化成氯胺，并使芳族氨基酸氯化。巨噬细胞是大的吞噬细胞，如PMNs能够吞噬微生物。巨噬细胞可产生过氧化氢，在激活后，还可产生髓过氧化物酶。此外，血浆中的髓过氧化物酶可被巨噬细胞摄取。髓过氧化物酶的活性与疾病之间的关联涉及到很多炎性疾病，包括阿尔茨海默氏病，多发性硬化，哮喘，动脉粥样硬化，癌症，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病，炎性肠病，和类风湿性关节炎。鉴定髓过氧化物酶抑制剂的测定法对于证实次氯酸对这种疾病发病机理的影响而言非常重要，还可用作诊断的工具。它们还可为研制抗髓过氧化物酶依赖性组织损害的有效药物提供平台。MPO抑制剂的适宜筛选测定法应在实际的生理条件下测量髓过氧化物酶的氯化活性。这种测定法必须简单，灵敏，而且可产生有色的或发荧光的产物，但不能干扰MPO的活性。检测剂的浓度要足够高，从而清除产生的所有次氯酸，但不能与酶直接反应。目前，最普遍使用的测定法是以从次氯酸和牛磺酸形成牛磺酸氯胺为基础的。先前利用这种牛磺酸氯胺测定法的改进形式测量髓过氧化物酶活性的尝试揭示了下列特定问题，即，否定了其用于筛选酶的可能抑制剂的用途。主要问题是，通常最适于溶解试验化合物的溶剂二甲基亚砜(DMSO)会干扰测定，而且很多试验化合物都在与通常所用发色团相同的区内吸收。生理上，PMN-衍生的髓过氧化物酶主要催化卤化物，如氯离子的过氧化氢依赖性氧化，但其利用电子供体，如O-联茴香胺作为底物的能力可形成测量发炎组织中PMNs的测定法的基础。方法适合就可避免由组织/血液成分，如胞质酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，还原性底物如谷胱甘肽和抗坏血酸，及血红素蛋白引起的假象，这些方法已经描述过(Grisham等，Methodsin Enzymology，Vol.186，Ed.Packer等，San DiegoAcademic Press，pp.729-742(1990))。然而，仍然需要一种更可靠的分析方法来测量发炎组织的PMN含量，而不会受到其它内源性组织成分的影响。本专利技术描述了一种简单，灵敏而且肯定的测定法，它可避免与目前已知测定法有关的主要问题，而且非常适于鉴定髓过氧化物酶的抑制剂。另一方面，本专利技术可用于与髓过氧化物酶有关的特定诊断试验。专利技术描述首先，本专利技术提供一种鉴定髓过氧化物酶(MPO)抑制剂的方法，该方法包括在有所述髓过氧化物酶的可能抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢和氯化物源反应，产生次氯酸；使所有形成的次氯酸与适宜的胺反应，形成相应的氯胺；任选除去所有未反应的过氧化氢；在有碘化物存在的条件下，使所有形成的氯胺与适宜的检测分子反应，形成氧化的检测分子；通过在适宜波长下测量吸光度或荧光而测定所形成的氧化检测分子的量；把引起所形成的氧化检测分子的量降低的那些化合物鉴定为髓过氧化物酶的抑制剂.在上述专利技术的其中一个实施方案中，所用的胺是牛磺酸，它可被次氯酸转化成牛磺酸氯胺。牛磺酸的适宜浓度约为5-10mM。在另一实施方案中，所有未反应的过氧化氢是用过氧化氢酶除去的。过氧化氢酶的适宜浓度约为10-20μM。氯化钠可用作适宜的氯化物源，例如，其量为大约50-150mM。可直接加入过氧化氢，或利用氧化酶，如葡萄糖氧化酶或黄嘌呤氧化酶原位酶促产生过氧化氢。过氧化氢的适宜浓度为10-100μM。在另一实施方案中，所用的检测分子是联苯胺衍生物。优选的联苯胺衍生物是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)，所形成的氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺是通过测量645-650nM处的吸光度而测定的。在可选择性的实施方案中，所述检测分子是一种荧光探针，如附图说明图1所示分子中的一种。图1 例如，可使用二氢罗丹明作为检测分子。把这种非荧光化合物氧化成罗丹明，当在500nm处照射时，其在536nm处发射荧光。更具体而言，本专利技术的方法包括在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢反应，产生次氯酸，并在含有氯化钠和10mM牛磺酸的适宜缓冲液中，使所有形成的次氯酸与牛磺酸反应，形成牛磺酸氯胺；任选加入过氧化氢酶至浓度高达约20μg/mL，从而除去所有残留的过氧化氢；在有碘化钾存在的条件下，在含有3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和10-20％二甲基甲酰胺的适宜缓冲液中，使所有形成的牛磺酸氯胺与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺反应，形成氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；并测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。可使用的缓冲液包括pH值5-8的适宜醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液。缓冲液的浓度应为至少10mM，优选至少20mM。优选与碘化钾的反应是在大约pH5.4进行的。因此，在其中一个具体实施方案中，本专利技术的方法包括在可能的髓过氧化物酶抑制剂(在化合物溶剂DMSO中的浓度为1％)存在的条件下，使髓过氧化物酶(2.5nM)与过氧化氢(100μM)和氯化钠(140mM)在pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中反应，产生次氯酸，并使所有形成的次氯酸与10mM牛磺酸反应，形成牛磺酸氯胺；通过加入溶解在二甲基甲酰胺中的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(10mM)，碘化钾(100μM)和冰醋酸(400mM)而终止测定并显色，其中的浓度为终浓度；然后测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。在另一具体实施方案中，本专利技术的方法包括在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶(5-20nM)与过氧化氢(100μM)反应，产生次氯酸，并在含有100mM氯化钠和10mM牛磺酸的pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中，使所有形成的次氯酸与牛磺酸反应，形成牛磺酸氯胺；加入20μM/mL浓度的过氧化氢酶以除去所有残留的过氧化氢；在有200μM碘化钾存在的条件下，在含有2mM 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和10-20％二甲基甲酰胺的pH5.4的200mM醋酸钠缓冲液中，使所有形成的牛磺酸氯胺与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺反应，形成氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；并测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。在另一具体实施方案中，本专利技术的方法包括在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶(2.7nM)与过氧化氢(50μM)在含有140mM氯化钠和10mM牛磺酸的pH6.5的20mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定髓过氧化物酶（ＭＰＯ）抑制剂的方法，该方法包括：　　　　在有所述髓过氧化物酶的可能抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢和氯化物源反应，产生次氯酸；　　　　使所有形成的次氯酸与适宜的胺反应，形成相应的氯胺；　　　　任选除去所有未反应的过氧化氢；　　　　在有碘化物存在的条件下，使所有形成的氯胺与适宜的检测分子反应，形成氧化的检测分子；　　　　通过在适宜的波长下测量吸光度或荧光而测定所形成的氧化检测分子的量；　　　　把引起所形成的氧化检测分子的量降低的那些化合物鉴定为髓过氧化物酶的抑制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A凯特尔，
申请(专利权)人：阿斯特拉曾尼卡有限公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]