一种抗体嵌合基因的构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种抗体嵌合基因的构建方法，其氨基酸序列连接的方向为重链（轻链）的氨基端→羧基端→链接区→轻链（重链）的羧基端→氨基端，其中的一条链和传统人工合成蛋白质的方向相反，传统方法的方向为重链（轻链）的氨基端→羧基端→链接区→轻链（重链）的氨基端→羧基端。本发明专利技术的序列连接方式类似于生物体内天然存在的状况，有更多的自由氨基端，在与抗原结合时形成空间构象，能不受限制地互相结合，用于筛选和分离多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，公开了一种抗体嵌合基因的构建方法，其中有一部分的氨基酸序列连接的方向和传统的方向相反，有更多的自由氨基端，类似于生物体内天然存在的情况，所构建的抗体嵌合基因经在噬菌体、细菌、病毒和细胞表面表达后，可以用来筛选和分离的多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。
技术介绍
抗原抗体反应是一种发生在高等生物体内的独特的生命现象。这种反应不仅与疾病的预防，而且也与许多疾病的发生有关。随着分子生物学研究的深入，人们对抗体的形成过程，及其调节有了较为全面的认识。制备抗体的方法目前分为二大类1.从生物个体的血清中分离，如用特定的抗原免疫动物，获得针对特定抗原的高免疫血清。目前在医学中使用的破伤风抗血清就是用这种方法制备的；2.利用基因工程和细胞工程的方法，从细胞或细菌中制备特异性的针对特定抗原的抗体。如利用细胞培养的方法制备单克隆抗体，或在大肠杆菌中表达单链免疫球蛋白等。在自然选择的过程中，许多与人体自身的组织和细胞反应的淋巴细胞均被清除，只是在一些特定的疾病才出现与我们自身的细胞或组织反应的抗体或淋巴细胞，而有时候我们需要一些与自身的细胞起反应的抗体用来治疗人体的疾病，如与肿瘤坏死因子结合的抗体，与免疫记忆细胞反应的抗体等等，通过与这些因子或细胞的结合可以加速体内的清除过程或死亡过程，从而降低这些疾病的危害。所有抗体分子都具有类似的基本结构单位，即由二条相同的轻链(25kDa左右)和二条相同的重链(55-70kDa)共同组成一个“Y”型的抗体分子结构，其中轻链与重链之间、二条重链之间均有二硫键联结，抗体分子立体结构属于球蛋白。轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)二个结构域组成。重链由一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3)结构域组成。VH和VL空间结构上互补形成抗原结合区域，又称FV片段。Fv和CH1和CL区域组成抗体的Fab段。二条重链的CH2和CH3通过二硫键联结组成Fc段。Fab段与Fc段之间有一个铰链区，将二者连接起来。整个结构分为氨基酸序列较为保守的位于羧基端的恒定区(CL)，和氨基酸序列多变的位于氨基端的变异区(VL)。氨基端的变异区又可以分为较为保守的骨架区(FR)和相间于其间的高度变异区(CDR)。免疫球蛋白分为5种，血清中含量最多的为IgG。IgG的轻链约有220个氨基酸，其中变异区和恒定区各有约110个氨基酸。人体的轻链有二种亚类，分别称之为λ和k。重链有440个氨基酸左右，其中变异区约有110个氨基酸，恒定区约有330个氨基酸。抗体的变异区为与抗原的结合区，决定抗体与抗原结合的特异性；恒定区为体内的功能效应区，在身体内与吞噬细胞等结合，促进相关抗原的清除。变异区与恒定区由1-40个氨基酸组成的铰链区连接，这样确保了变异区和恒定区各自的功能不受干扰，使得Fab段得以灵活旋转而结合抗原。重链和氢链的变异区从氨基端开始分别为FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4区域。抗体是一种十分复杂的分子。根据保守的骨架区(FR1)的基因序列和高变区与恒定区之间的连接区基因序列设计的聚合酶链反应引物，可以对所有的人类的抗体基因的变异区进行扩增，即获得人类的相关的免疫球蛋白基因。利用这种方法，可以从一个个体的外周血B淋巴细胞中分离为mRNA，再通过反转录等方法，制备成为cDNA，再通过适当的表达载体表达该基因，而获得该个体特异性的免疫球蛋白，这种免疫球蛋白可以用于许多疾病如类风湿性关节炎、肿瘤等的治疗。与从动物如老鼠或其他人所得的抗体相比，这种抗体更具有免疫同源性，这样会取得更好的疗效。目前在利用大肠杆菌生产重组抗体的过程中，最常见的方法为将重链和氢链各自的变异区克隆，然后再在二者之间加上一条链接区，形成如下的结构VH→链接区→VL或VL→链接区→VH1即通过链接区将重链变异区的羧基端和轻链变异区的氨基端结合在一起，形成一条单链免疫球蛋白，称之为scFv。由于在正常情况下，免疫球蛋白轻重链的氨基端是自由的，不受任何限制，因此，可以形成较好的抗原结合位点。而在scFV，其中一条免疫球蛋白变异区的氨基端与另一条免疫球蛋白的羧基端通过链接区连接在一起，因此，其中有一条变异区的氨基端的活动受到限制，进而会使抗原和抗体的结合受到限制。基因片段具有方向性，即在细胞内复制、转录和翻译时，合成的方向只能从5’端到3’端。因此，在体外基因的构建过程中，必须遵循这一原则，方能得到活性的产物。随着人类基因组工作测序工作的完成，在与基因相关的领域取得了长足的进展。目前可以对基因进行全部的人工合成，且费用不是特别昂贵，需要的时间也不长。整个过程在一般的具有分子生物学实验条件的实验室中，通过人工合成的核酸片段，再通过聚合酶链反应拼接，测序等方法来完成。通过对基因的人工合成，不仅可以根据所用细胞的兼并密码子的使用频率来调整基因的序列，以提高蛋白的翻译水平，同时也可以根据氨基酸序列，利用分子生物学的手段，来构建全新的分子，不再受到传统的基因方向性原则的限制，即可以通过人工合成的方法，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸利用细胞的蛋白合成机制来合成。
技术实现思路
专利技术目的克服上述在重组抗体或抗体文库过程中的缺点，以使形成的人工分子的氨基端区域不受限制的相互作用，更真实地模拟所表达分子的天然情形，是本专利技术的目的。为了实现本专利技术的目的所采取的方案1、一种抗体嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时，方向为第一(或第二)链由重链(轻链)的氨基端到羧基端，通过链接区链接第二(或第一)链由轻链(重链)其特征是所述的第一链和第二链都以羧基端和链接区相连，所述的第二链(或第一)由轻链(重链)的方向为从羧基端到氨基端；形成一条完整的DNA链的嵌合基因序列的方向为第一(或第二)链由重链(轻链)的氨基端→羧基端→链接区→第二(或第一)链由轻链(重链)的羧基端→氨基端。2、所述的第一链和第二链含有骨架FR1、FR2、FR3、FR4及FC区域，和高变区CDR1、CDR2、CDR3，其特征是所述的第一链和第二链为一种免疫球蛋白的全部或部分基因片段，是来自特定个体或种群的基因片段；是确切的核苷酸序列或是随机的核苷酸序列。3、所述的链接区由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列，一般为苷氨酸和丝氨酸组成的链接序列。4、所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以使嵌合基因表达产物纯化。5、所述的琥珀终止密码子UAG的后面通过链接区连接噬菌体的基因片段，使其与外源性基因片段融合，并表达于噬菌体的表面，利于蛋白之间互相作用的深入研究。6、一种嵌合基因的构建方法的应用，通过逆转录、聚合酶链反应、拼接、测序和人工合成常见的分子生物学方法，证明用本专利技术的嵌合基因的构建方法所构建的嵌合基因，其特征是使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有更多的自由氨基端，和生物体内天然存在的状况类似，使抗体和抗原自由结合，形成空间构象，用于筛选和分离多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。利用现有的分子生物学技术，通过分离特定个体的外周血淋巴细胞，经逆转录-聚合酶链反应和测序，确定个体特异性的免疫球蛋白基因序列，然后再根据所获得的序列，经人工合成基因片段和聚合酶链反应拼接手段，建立一种免疫球蛋白的随机基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时，方向为第一（或第二）链由重链（轻链）的氨基端到羧基端，通过链接区链接第二（或第一）链由轻链（重链）。其特征是所述的第一链和第二链都以羧基端和链接区相连，所述的第二链（或第一）由轻链（重链）的方向为从羧基端到氨基端；形成一条完整的ＤＮＡ链的嵌合基因序列的方向为：　　　　第一（或第二）链由重链（轻链）的氨基端→羧基端→链接区→第二（或第一）链由轻链（重链）的羧基端→氨基端。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉荣，迟云发，
申请(专利权)人：北京神洲天才科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]