一种改造基因的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种可以在体内被特异性的重组酶所辨认的序列，将其利用人工合成的方法加入到筛选标记的两端，再将所需要插入的基因及其来自生物体的所需插入点两侧的同源序列，一并通过聚合酶链反应或分步克隆到质粒中，将聚合酶链反应片段或质粒转到生物体内，在获得所需要的生物体性状后，可以将来自生物体的强促进子控制下的、表达特异性重组酶的质粒转入到生物体内，将整合到染色体中的筛选标记切除。这样，就可以利用同一标记对生物体进行反复的基因修改如整个代谢途径的加入等，而达到对生物体进行复杂改造的目的。本发明专利技术可以用于生物体的基因组改造。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，公开了，与传统的方法相比，其可以用同一标记对基因组进行复杂的改造，如多基因的灭活，外源基因的引入，或通过引入基因调控序列，对基因的表达进行调控。可以用于对基因组进行复杂的改造。
技术介绍
随着对许多有机体包括病毒、细菌、真菌和人类的基因组序列测定的完成，为基因组有目的的人工改造提供了一种前所未有的机会。通过对已知微生物的人工改造，可以使微生物改善原有的性状、获得前所未有的性状，以及通过对不同微生物的代谢途径的人工整合，使人类获得全新的微生物，为人类生产新的化工原料，分解各种环境污染物，提供新的能源和食品等。同时也可以通过对致病微生物的毒性因子的定向灭活，使其在具备诱导机体产生免疫性保护作用的同时，失去使人体致病的能力。通过对真核生物的基因改造，使其能够在保持其生物性状的同时，延长其寿命等。总之，基因组序列测定的完成，为人类研究、改造和利用生物有机体提供了前所未有的机会。 在自然的进化过程中，生物各种基因以及代谢途径之间有着非常微妙的平衡关系，生物对其周围环境有着准确的感知和反应，同时生物之间也有着相互的制约和控制。要到达对生物的基因组进行人工改造，则必须准确把握这种关系。而准确把握这种关系的关键所在为能够对所需要灭活或引进的基因在染色体上进行精确的定位。 要将外源的基因引入生物体内，必须有一种标记使其能够区分整合有外源基因的生物。最常见的为各种抗生素的耐药基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素和四环素等。加入抗生素耐药基因可以帮助区分带有外源基因的生物，但加入抗生素的耐药基因可以造成耐药性的扩散，同时由于目前各种抗生素种类有限，因此，如果不去掉抗生素耐药基因，则仅能在一种生物体内改造几种基因。同时，要确保抗生索在生物体内的表达，必须使抗生素耐药基因的表达受控于来自生物体自身的强的促进子。 若要将外源基因引入生物体内，必须在外源基因的两侧连接有来自生物体染色体且必须是在所需插入位点两侧的DNA序列。DNA序列的长度是越长越好，但根据所需插入的生物体种类不同，50-1000个碱基对就足以完成同源重组。这种同源序列可以确保外源基因插入到同源序列所限定的基因组的位点中。 一种基于大肠杆菌的λ噬菌体的基因重组系统，利用噬菌体编码的核酸外切酶、单链DNA结合蛋白和可以抑制宿主降解噬菌体DNA的蛋白，再加上宿主的许多与DNA复制有关的蛋白的配合，可以有效地促进外源基因的整合。但这种系统仅能够在大肠杆菌和伤寒杆菌中起作用，因为只有这二种细菌的蛋白能够与噬菌体所编码的蛋白相互作用。
技术实现思路
专利技术的目的为了克服目前利用λ噬菌体的基因重组系统方法只能在有限种类的细菌中进行基因改造的缺点，使其能够更广泛地应用更多的细菌，特别是工业和医学上重要的菌株的改造，生产人类需要的生物原料和疫苗，为本专利技术的目的。 为了实现本专利技术的目的，所采取的方案1、一种基因的染色体定向整合方法，其特征为在所需整合的基因两侧含有来自所需转入的有机体染色体的同源序列，和一种可以促进基因定向整合并可在有机体内去除的筛选标记，且这种核酸序列可以直接转入到有机体内和通过特异性的质粒转入到有机体内。 2、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因的染色体定向整合方法，其特征为在所需整合的基因两侧含有来自所需转入的有机体染色体的同源序列，和一种可以促进基因定向整合并可在有机体内去除的筛选标记，且这种核酸序列可以直接转入到有机体内和通过特异性的质粒转入到有机体内。

【技术特征摘要】
书1所述，在所需整合的基因的两侧的同源序列来自于所需整合的有机体的染色体，其长度为50-5000碱基对，最适长度为50-1000碱基对。 3、如权利要求书2所述，所需整合的基因两侧的同源序列，可以通过聚合酶链反应，或分步克隆连接在一起。 4、如权利要求书1所述，一种可以促进基因定向整合的筛选标记可以为抗生素耐药基因，营养缺陷型的互补基因，或重金属抵抗基因。 5、如权利要求书4所述，在筛选标记的基因两侧含有特异性重组酶的辨认序列。 6、如权利要求书1所述，所需要定向整合的基因、筛选标记和同源序列所构成的DNA片段可以通过质粒或以DNA片段的形式转化到有机体内。 7、如权利要求书1所述，在完成基因的染色体定向整合之后，可以将由来自有机体的强促进子控制的特异性重组酶的表达质粒转入到有机体内，去除筛选标记。 8、如权利要求书1-7项所述的方法可以用于基因功能的灭活，基因功能的改造和调控。具体实施方式谷氨酸棒状杆菌是一种广泛用于发酵工业的菌株，其不仅用于谷氨酸、赖氨酸等氨基酸的生产，也有人开始利用其进行酒精的发酵。在氨基酸的生产过程中，磷酸戊糖代谢通路提供了最基本的起始的化合物。因此，调节这一通路的代谢活性，对利用这一发酵工业菌株提高现有的氨基酸产量，或开发具有新的生产能力的菌株具有一定的意义。 6-磷酸葡萄糖异构酶催化6-磷酸葡萄糖转变成6-磷酸果糖，是葡萄糖进入糖酵解或磷酸戊糖通路的控制酶之一。如果将其在细菌的基因组上灭活，则可以使进入细菌的葡萄糖进入磷酸戊糖通路，这样就可以提高相关的氨基酸的产量。 谷氨酸棒状杆菌只能利用几种有限的糖类作为其能源，其缺乏代谢木糖的关键酶，木糖异构酶，其催化木糖到木酮糖的反应。若在谷氨酸棒状杆菌的基因组中引入木糖异构酶，则可以利用秸秆等的降解产物来发酵氨基酸，或可以用于生产酒精等。 下面为本发明的应用过程，首先是在基因组上灭活6-磷酸葡萄糖异构酶，然后是在基因组的同一位置引入来自大肠杆菌的木糖异构酶基因，说明如何利用本发明在灭活6-磷酸葡萄糖异构酶的同时引入木糖异构酶。 1.谷氨酸棒状杆菌乳酸脱氢酶促进子的克隆1.1根据已经公布的谷氨酸棒状杆菌的基因组序列，首先设计了下面一对聚合酶链反应(PCR)引物，用于扩增乳酸脱氢酶促进子上下游的基因序列序列15’TAAAGCCAGCGCCCATATTTGCAG3’序列25’AATGACAACCATGGCTGCGTCTTC3’然后建立如下的PCR反应体系10 X Taq DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列1 5.0uL2uM序列2 5.0uL10ng/ul谷氨酸棒状杆菌染色体DNA 5.0uL5u/ulTaq DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应 94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从琼脂糖凝胶上回收652bp的DNA片断，并将溶于去离子水中，使其浓度为1ng/uL。 1.2根据已经公布的谷氨酸棒状杆菌的基因组序列，设计了一对PCR引物，用于扩增乳酸脱氢酶基因的促进子，并使序列3含有限制性内切酶Nsil，Mlul和特异性的重组酶的辨认序列，以及使序列4含有限制性内切酶Ndel的辨认序列序 列 3 5’GGATCCATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACT A GCTCTGCAATGACCTG3’序列45’GGATCC CATATG CGATCCCACTTCCTGATTTCCCTAA3’然后利用1.1所得的DNA片断为模板，建立如下的PCR反应体系10 X Taq DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列3 5.0uL2uM序列4 5.0uL1ng/ul得自步骤1.1的DNA片断 5.0uL5u/ulTaq DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从琼脂糖凝胶上回收395bp的DNA片断，并溶于30uL得去离子水中。 1.3将步骤1.2所得的DNA片断通过下列缓冲系统分别用NsiI和NdeI酶切，并连接于用同样酶切处理的克隆载体pGEM-T中。 1.3.110 X NEB缓冲液3 5.0uL395bp得自步骤1.2的DNA片断 30.0uL10u/ul Nsil 2.0uL去离子水 13.0uL和10 X NEB缓冲液3 5.0uLpGEM-T 100ng/ul 30.0uL10u/ul Nsil 2.0uL去离子水 13.0uL37℃ 4小时。 然后用Qiagen公司生产的PCR纯化试剂盒纯化上述的酶切反应物，并分别洗脱于30uL的去离子水中。然后，再进行下列的反应1.3.210 X NEB缓冲液4 5.0uL395bp得自步骤1.3.1的DNA片断 30.0uL 10u/ul Ndel 2.0uL去离子水 13.0uL10 X NEB缓冲液4 5.0uLpGEM-T得自步骤1.3.1 30.0uL10u/ul Ndel 2.0uL去离子水 13.0uL37℃ 4小时。 1.3.3从1％琼脂糖凝胶上分别回收1.3.2的PCR和pGEM-T的酶切片断，并通过下列体系将二者连接在一起10 X NEB T4 DNA连接酶缓冲液 2.0uLPCR片断 12.0uLPGEM-T 5.0uL200u/ul T4 DNA连接酶 1.0uL16℃ 12小时。 1.3.4.向步骤1.3.3的反应产物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸钠，加入80uL的无水酒精，混匀后，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，于空气中干燥10分钟后，溶于10uL的去离子水中。 1.3.5将步骤1.3.4的反应产物5uL加入到95uL的大肠杆菌DH5a的感受态细胞中，置入冰浴中30分钟，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分钟，加入1毫升的LB细菌培养液，并于37℃培养1小时。然后分别将100uL和900uL的培养液涂抹在含有氨苄青霉素和X-Gal的培养基上，于37℃生长14-16小时。 1.3.6从步骤1.3.5的培养皿上挑取单个白色的菌落，于氨苄青霉素的LB细菌培养液中培养，经过酶切和测序，将其命名为pBJSZ129，其整个DNA序列编号为序列5，见序列列表第1页。 2.将氯霉素的抗性基因克隆pBJSZ129质粒中2.1根据已知的pACYC184质粒的序列，设计下列PCR引物用于扩增氯霉素的抗性基因，并使序列6含有限制性内切酶Ndel的辨认序列，序列7含有特异性的重组酶的辨认序列以及限制性内切酶Apal的辨认序列。 序列65’GGATCCCATATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACC3’序列75’GGATCCGGGCCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGTTAC GCCCCGCCCTGCCAC3’然后建立如下的PCR反应体系10 X Taq DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列6 5.0uL2uM序列7 5.0uL10ng/ul pACYC184 DNA 5.0uL5u/ulTaq DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒 72℃ 30秒循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从琼脂糖凝胶上回收726bp的DNA片断，并溶于30uL的去离子水中。 2.2将步骤2.1所得的氯霉素耐药基因的DNA片断和pBJZH129质粒用限制性内切酶NdeI和ApaI通过下列系统进行酶切处理10 X NEB缓冲液系统4 5.0uL氯霉素耐药基因片断 30.0uLNdeI 10u/ul 2.0uLApaI 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL去离子水 10.5uL10 X NEB缓冲液系统4 5.0uLpBJSZ129(100ng/ul) 30.0uLNdeI 10u/ul 2.0uLApaI 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL去离子水 10.5uL于37℃反应4小时。 2.3从1％琼脂糖凝胶上分别回收氯霉素耐药基因和pBJSZ129的酶切片断，并通过下列体系将二者连接在一起10 X NEB T4 DNA连接酶缓冲液 2.0uL氯霉素耐药基因片断 12.0uLpBJSZ129 5.0uL200u/ul T4 DNA连接酶 1.0uL于16℃反应12小时。 2.4.向步骤2.3的反应产物中加入5uL 5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸钠，加入80uL的无水酒精，混匀后，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，于空气中干燥10分钟后，溶于10uL的去离子水中。 2.5将步骤2.4的反应产物5uL加入到95uL的大肠杆菌DH5a的感受态细胞中，置入冰浴中30分钟，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分钟，加入1毫升的LB细菌培养液，并于37℃培养1小时。然后分别将100uL和900uL的培养液涂抹在含有氯霉素的培养基上，于37℃生长18-20小时。 2.6从步骤2.5的培养基上挑取单个菌落，于氯霉素的LB细菌培养液中培养，经过酶切和测序，将其命名为pBJSZ130，其完整的DNA序列为序列8，见序列列表第2页2.7根据pBJSZ130的序列，设计了一对可以用于扩增包括重组酶特异性的辨认序列、乳酸脱氢酶促进子和氯霉素耐药基因的通用PCR引物。该PCR产物将用于步骤3的重叠PCR. 序列95’ACGCCAAGCTATTTAGGTGACACT3’序列105’GATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT3’然后建立如下的PCR反应体系10 X KOD XL DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列9 5.0uL2uM序列10 5.0uL 10ng/ul pBJSZ1 30DNA 5.0uL2.5u/ul KOD XL DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 60秒循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从琼脂糖凝胶上回收1249bp的DNA片断，并溶于50uL的去离子水中。其DNA序列为序列11，见序列列表第3页。 3.谷氨酸棒状杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶同源序列的克隆3.1根据已经公布的谷氨酸棒状杆菌的基因组序列，设计了下列二队PCR引物，分别用于扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶的上游和下游的同源基因序列，并使其中的序列13和序列14的5’端含有分别与序列9和10互补的序列，和序列13含有限制性内切酶Mlul和Sacll的辨认序列，以及序列12和序列15含有限制性内切酶Notl的特异性的辨认序列。 序列125’GGATCCGAATTC GCGGCCGC ATCAGCACCGACAAACACGATCCT3’序列135’AGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTACGCGTTGGCCACCGCGGAGTGGTTGCCTGGAA GTTTGAGTA3’序列145’ACCCTGGCGTTACCCAACTTAATC TGGGACATCAACTCCTTCGACCAA3’序列155’GGATCCGAATTC GCGGCCGC ACTCCCTAACAGCAATCGGAAGCA3’然后建立如下的PCR反应体系10 X KOD XL DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列12 5.0uL2uM序列13 5.0uL10ng/ul谷氨酸棒状杆菌染色体DNA 5.0uL2.5u/ul KOD XL DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL和10 X KOD XL DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列14 5.0uL2uM序列15 5.0uL10ng/ul谷氨酸棒状杆菌染色体DNA 5.0uL2.5u/ul KOD XL DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 60秒循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从1％的琼脂糖凝胶上分别回收649bp和580bp的DNA片断，并溶于50uL的去离子水中。其中上游同源序列为序列16，见序列列表第3页；下游同源序列为序列17，见序列列表第3页。 3.2利用重叠PCR将步骤2.7所得的由乳酸脱氢酶促进子控制的氯霉素耐药基因和步骤3.1所得的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的上游和下游同源序列连接在一起。 建立如下的PCR反应体系10 X KOD XL DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列12 5.0uL2uM序列15 5.0uL序列11 3.0uL序列16 3.0uL序列17 3.0uL2.5单位/uLKOD XL DNA聚合酶 0.5uL去离子水 19.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 3分钟循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从1％的琼脂糖凝胶上回收2495bp的DNA片断，并溶于50uL的去离子水中。其DNA序列为序列18，见序列列表第3页。 3.3将序列18和pBJSZ82质粒分别用限制性内切酶NotI在下列系统中进行酶切处理；10 X NEB缓冲液系统3 6.0uL序列18 DNA片断 50.0uLNotI 10u/ul 2.0uL100X BSA 0.5uL去离子水 1.5uL和10 X NEB缓冲液系统3 6.0uLpBJSZ82 20ng/ul 50.0uLNotI 10u/ul 2.0uL100X BSA 0.5uL去离子水 1.5uL37℃反应4小时，然后在pBJSZ82的反应液中加入1uL的小牛肠道碱性磷酸酶，再在37℃反应1小时。 然后从1％琼脂糖凝胶上分别回收序列18和pBJSZ82的酶切片断，并通过下列体系将二者连接在一起10 X NEB T4 DNA连接酶缓冲液 2.0uL氯霉素耐药基因片断 12.0uLpBJSZ129 5.0uL200u/ul T4 DNA连接酶 1.0uL于16℃反应12小时。 3.4.向步骤3.3的反应产物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸钠，加入80uL的无水酒精，混匀后，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，于空气中干燥10分钟后，溶于10uL的去离子水中。 3.5将步骤2.4的反应产物5uL加入到95uL的大肠杆菌DH5a的感受态细胞中，置入冰浴中30分钟，然后再置入42℃的水浴中90秒，加入1毫升的LB细菌培养液，并于37℃培养1小时。然后分别将100uL和900uL的培养液涂抹在含有氯霉素的培养基上，于37℃生长18-20小时。 3.6从步骤3.5的培养基上挑取单个菌落，于氯霉素的LB细菌培养液中培养，经过酶切和测序，将其命名为pBJSZ133。其DNA序列为序列19，见序列列表第4页。 4.大肠杆菌木糖异构酶基因的克隆4.1根据已公布的大肠杆菌的基因组序列设计了下面一对引物用于扩增包括木糖异构酶基因在内的一段DNA序列序列205’ATCACCCGCGGCATTACCTGATTA3’序列215’CTTTCATTGCGCGATCAGTTGCCT3’建立如下的PCR反应体系10 X KOD XL DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列20 5.0uL2uM序列21 5.0uL10纳克/uL的大肠杆菌染色A 5.0uL2.5单位/uLKOD XL DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从1％的琼脂糖凝胶上回收1601bp的DNA片断，并溶于50uL的去离子水中。 4.2根据已公布的大肠杆菌的基因组序列设计了下面一对引物用于扩增木糖异构酶的编码基因序列，并使序列22含有限制性内切酶NdeI和序列23含有限制性内切酶Sacll的辨认序列序列225’GGATCCCAT ATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTC3’序列235’GGATCCCCGCGGTCTGGTAAACCATTATCTGTTCGACAAATAA3’建立如下的PCR反应体系10 X KOD XL DNA聚合酶缓冲液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列22 5.0uL2uM序列23 5.0uL得自步骤4.1的PCR片断 5.0uL2.5单位/uLKOD XL DNA聚合酶 0.5uL去离子水 24.5uL混匀后，在基因扩增仪上进行下列反应94℃ 2分钟，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循环30次，最后在72℃延伸10分钟。 从1％的琼脂糖凝胶上回收1347bp的DNA片断，并溶于50uL的去离子水中。其DNA序列为序列24，见序列列表第5页。 4.3通过酶切和连接反应将序列24克隆到pBJSZ129质粒中4.3.1建立如下的酶切反应体系10 X NEB缓冲液系统4 6.0uL序列24 DNA片断 49.5uLNdeI 10u/ul 2.0uLSacII 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL和10 X NEB缓冲液系统4 6.0uLpBJSZ129 50ng/ul 49.5uLNdeI 10u/ul 2.0uLSacII 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL于37℃反应4小时。 4.3.2从1％琼脂糖凝胶上分别回收序列24和pBJSZ129的酶切片断，并通过下列体系将二者连接在一起10 X NEB T4 DNA连接酶缓冲液 2.0uL序列24的基因片断 12.0uLpBJSZ129 5.0uL200u/ul T4 DNA连接酶 1.0uL于16℃反应12小时。 4.3.3向步骤4.3.2的反应产物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸钠，加入80uL的无水酒精，混匀后，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，于空气中干燥10分钟后，溶于10uL的去离子水中。 4.3.4将步骤4.3.2的反应产物5uL加入到95uL的大肠杆菌DH5a的感受态细胞中，置入冰浴中30分钟，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分钟，加入1毫升的LB细菌培养液，并于37℃培养1小时。然后分别将100uL和900uL的培养液涂抹在含有氨苄青霉素的培养基上，于37℃生长14-16小时。 4.3.5从步骤4.3.4的培养基上挑取单个菌落，于氨苄青霉素的LB细菌培养液中培养，经过酶切和测序，将其命名为pBJSZ134。其DNA序列为序列25，见序列列表第6页。 5.将在乳酸脱氢酶促进子控制下的木糖异构酶连接到6-磷酸葡萄糖异构酶同源序列所在的质粒pBJSZ133中(序列19)，构建新的质粒pBJSZ135，以达到灭活6-磷酸葡萄糖异构酶的同时，引入外源基因木糖异构酶。 5.1用限制性内切酶Mlul和Sacll分别消化pBJSZ133(序列19)和pBJSZ134(序列25)10 X NEB缓冲液3 5.0uL序列19 500ng/ul 5.0uLMlul 10u/ul 2.5uL去离子水 37.5uL和10 X NEB缓冲液3 5.0uL序列25 500ng/ul 10.0uLMlul 10u/ul 5.0uL去离子水 30.0uL 于37℃反应4小时。然后用酚/氯仿抽提酶切反应物，加入10uL3M醋酸钠，150uL的无水酒精，于12000转/分钟离心15分钟，弃上清，加入70％的酒精再离心15分钟，弃上清。于空气中干燥10分钟。然后，再建立下列反应体系10 X NEB缓冲液4 5.0uLMlul消化的序列19 5.0uLSacll 10u/ul 2.5uL去离子水 37.5uL和10 X NEB缓冲液3 5.0uLMlul消化的序列25 5.0uLSacll 10u/ul 5.0uL去离子水 35.0uL于37℃反应4小时。然后从1％琼脂糖凝胶上分别回收序列19和从序列25中释放出来的1725bp的酶切片断，并通过下列体系将二者连接在一起10 X NEB T4 DNA连接酶缓冲液 2.0uL序列25中释放的1725bp的基因片断 12.0uL序列19 5.0uL200u/ul T4 DNA连接酶 1.0uL于16℃反应12小时。 5.2向步骤5.1的反应产物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸钠，加入80uL的无水酒精，混匀后，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000转/分钟离心15分钟。弃掉上清，于空气中干燥10分钟后，溶于10uL的去离子水中。 5.3将步骤5.2的反应产物5uL加入到95uL的大肠杆菌DH5a的感受态细胞中，置入冰浴中30分钟，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分钟，加入1毫升的LB细菌培养液，并于37℃培养1小时。然后分别将100uL和900uL的培养液涂抹在含有氯霉素的培养基上，于37℃生长18-20小时。 5.4从步骤5.3的培养基上挑取单个菌落，于含有氯霉素的LB细菌培养液中培养，经酶切和序列测定，获得的质粒为pBJSZ135。其序列为序列26，见序列列表第7页。 6.序列27为温度敏感性的表达特异性重组酶的质粒，被命名为pBJSZ83。其序列见序列列表第9页。 7.将pBJSZ133(序列19)电转到谷氨酸棒状杆菌sBJSZ105中，并对染色体整合产物进行鉴定7.1从营养肉汤琼脂培养基上提取单个菌落，并接种到营养肉汤培养液中于37℃培养16个小时，然后1∶50稀释，再于37℃培养3-4小时。离心收集细菌，用无菌去离子水洗二遍，然后悬浮在15％的甘油中。 7.2在离心管中加入序列19 20ug，在2500伏，用间隙为0.2厘米的电转杯经电转仪转入到细菌中，立即加入肉汤营养液，并涂抹在含有氯霉素的肉汤营养琼脂培养基上。 7.3挑取单个菌落在含有氯霉素的营养肉汤培养液中于37℃培养16个小时，然后再1∶1000稀释于37℃培养16个小时后，最后涂抹在含有氯霉素的肉汤营养琼脂培养基上。 7.4挑取单个菌落，用序列12和序列15做引物，进行PCR反应，野生株会得到2534bp的产物，而变异株则得到2454bp的PCR产物。PCR产物经纯化，用NdeI酶切处理，野生株仍为2534bp，变异株则得到1091bp和1403bp的二个片断。 7.5将明确发生变异的单个菌株于肉汤培养液中在37℃培养16个小时，然后1∶50稀释，再于37℃培养3-4小时。离心收集细菌，用无菌去离子水洗二遍，然后悬浮在15％的甘油中。 7.6在离心管中加入温度敏感的编码特异性重组酶的pBJSZ83(序列27)0.5ug，在2500伏，用间隙为0.2厘米的电转杯经电转仪转入到细菌中，立即加入肉汤营养液，并涂抹在含有氨苄青霉素的肉汤营养琼脂培养基上，于30℃培养20小时。 7.7将单个菌落分别对称有序地涂抹在不含和含有氯霉素的肉汤营养琼脂培养基上。对氯霉素敏感的菌落，表明特异性的重组酶已经将氯霉素耐药基因切除。 7.8将氯霉素敏感的单个菌落于肉汤培养液中在37℃培养4个小时，然后涂抹在不含抗生素的肉汤营养琼脂培养基上，于42℃过夜培养。 7.9将单个菌落分别对称有序地涂抹在不含和含有青霉素的肉汤营养琼脂培养基上。对青霉素敏感的菌落，表明细菌已经丢失了表达特异性重组酶的质粒。而该细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶已经被灭活。 8.将pBJSZ135(序列26)电转到谷氨酸棒状杆菌sBJSZ105中，并对染色体整合产物进行鉴定8.1从营养肉汤琼脂培养基上提取单个菌落，并接种到营养肉汤培养液中于37℃培养16个小时，然后1∶50稀释，再于37℃培养3-4小时。离心收集细菌，用无菌去离子水洗二遍，然后悬浮在15％的甘油中。 8.2在离心管中加入序列26 20ug，在2500伏，用间隙为0.2厘米的电转杯经电转仪转入到细菌中，立即加入肉汤营养液，并涂抹在含有氯霉素的肉汤营养琼脂培养基上。 8.3挑取单个菌落在含有氯霉素的营养肉汤培养液中于37℃培养16个小时，然后再1∶1000稀释于37℃培养16个小时后，最后涂抹在含有氯霉素的肉汤营养琼脂培养基上。 8.4挑取单个菌落，用序列12和序列15做引物，进行PCR反应，野生株会得到2534bp的产物，而变异株则得到4156bp的PCR产物。PCR产物经纯化，用NdeI酶切处理，野生株仍为2534bp，变异株则得到852bp，1377bp和1927bp的三个片断。 8.5将明确发生变异的单个菌株于肉汤培养液中在37℃培养16个小时，然后1∶50稀释，再于37℃培养3-4小时。离心收集细菌，用无菌去离子水洗二遍，然后悬浮在15％的甘油中。 8.6在离心管中加入温度敏感的编码特异性重组酶的pBJSZ83(序列27)0.5ug，在2500伏，用间隙为0.2厘米的电转杯经电转仪转入到细菌中，立即加入肉汤营养液，并涂抹在含有氨苄青霉素的肉汤营养琼脂培养基上，于30℃培养20小时。 8.7将单个菌落分别对称有序地涂抹在不含和含有氯霉素的肉汤营养琼脂培养基上。对氯霉素敏感的菌落，表明特异性的重组酶已经将氯霉素耐药基因切除。 8.8将氯霉素敏感的单个菌落于肉汤培养液中在37℃培养4个小时，然后涂抹在不含抗生素的肉汤营养琼脂培养基上，于42℃过夜培养。 8.9将单个菌落分别对称有序地涂抹在不含和含有青霉素的肉汤营养琼脂培养基上。对青霉素敏感的菌落，表明细菌已经丢失了表达特异性重组酶的质粒。 8.10挑取单个菌落，用序列12和序列15做引物，进行PCR反应，野生株会得到2534bp的产物，而变异株则得到3050bp的PCR产物。PCR产物经纯化，用NdeI酶切处理，野生株仍为2534bp，变异株则得到1123bp和1927bp的二个片断。则表明该菌株在6-磷酸葡萄糖脱氢酶被灭活的同时也置换入了木糖异构酶的基因。 一种改造基因的方法序列15’TAAAGCCAGCGCCCATATTTGCAG3’序列25’AATGACAACCATGGCTGCGTCTTC3’序列35’GGATCCATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACTAGCTCTGCAATGACCTG3’序列45’GGATCC CATATG CGATCCCACTTCCTGATTTCCCTAA3’序列55’TATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACTAGCTCTGCAATGACCTGCGCGCCGAGGGAGGCGAGGTGGGTGGCAGGTTTTAGTGCGGGTTTAAGCGTTGCCAGGCGAGTGGTGAGCAGAGACGCTAGTCTGGGGAGCGAAACCATATTGAGTCATCTTGGCAGAGCATGCACAATTCTGCAGGGCATAGGTTGGTTTTGCTCGATTTACAATGTGATTTTTTCAACAAAAATAACACTTGGTCTGACCACATTTTCGGACATAATCGGGCATAATTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGCTCTTGCTGATTTTCTGAGCTGCTTTGTGGGTTGTCCGGTTAGGGAAATCAGGAAGTGGGATCGCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATATCGAATTCCCGCGGCCGC CATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCC3’序列65’GGATCCCATATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACC3’序列75’GGATCCGGGCCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGTTACGCCCCGCCCTGCCAC3’序列85’TATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACTAGCTCTGCAATGACCTGCGCGCCGAGGGAGGCGAGGTGGGTGGCAGGTTTTAGTGCGGGTTTAAGCGTTGCCAGGCGAGTGGTGAGCAGAGACGCTAGTCTGGGGAGCGAAACCATATTGAGTCATCTTGGCAGAGCATGCACAATTCTGCAGGGCATAGGTTGGTTTTGCTCGATTTACAATGTGATTTTTTCAACAAAAATAACACTTGGTCTGACCACATTTTCGGACATAATCGGGCATAATTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGCTCTTGCTGATTTTCTGAGCTGCTTTGTGGGTTGTCCGGTTAGGGAAATCAGGAAGTGGGATCGCATATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGG 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【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉荣，迟云发，
申请(专利权)人：北京神洲天才科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]