白菜育性相关基因BcMF6及其分离方法技术

本发明专利技术涉及白菜育性相关基因ＢＣＭＦ６及其分离方法，以‘矮脚黄’白菜隐性雄性不育两用系为材料，采用ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ方法对白菜可育株系和不育株系的时空表达特征进行分析，分离与育性基因相关的差异表达基因ＢｃＭＦ６；通过ＲＡＣＥ技术获得其ｃＤＮＡ全长序列，进而获得其ＤＮＡ全长序列，并对全长序列进行生物信息学分析；构建了其反义ＲＮＡ表达载体，用农杆菌介导的方法转化到白菜的近缘物种菜心，对ＢｃＭＦ６基因的功能进行了验证，结果表明ＢｃＭＦ６为一个在花粉的成熟和萌发过程中起作用的多聚半乳糖醛酸酶基因，其表达与花药的绒毡层存在密切的联系，且其表达模式可能是配子体表达模式，参与花粉育性的决定，当其表达受到抑制后，引起花粉畸形、败育。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及白菜育性相关基因BCMF6及其分离方法，属于生物

技术介绍
cDNA-AFLP方法可以用于分析同一基因表达上的差异，获得与重要农艺性状相关的标记探针。结合文库筛选、染色体步移、RACE技术等实验手段，能够得到与重要农艺性状相关的全长基因序列。本专利技术采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜(Brassciacampestris L.ssp.chinensis Makino var.communis Tsen et Lee cv.Aijiaohuang)核不育两用系表达差异分析，发现可育株系与不育株系的表达差异主要存在于花药，配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF6，但其确切的生物学功能还不清楚。在后基因组时代，基因组研究的重点已经从基因序列的获得转移到基因具体功能的分析，而反义遗传学已成为分析基因功能的重要手段。为了明确BCMF6在花粉育性决定过程中的作用，有必要采用反义遗传学的方法和手段对其功能进行分析，为阐明植物雄性不育发生的分子机制提供依据，进而为人工创建不育材料提供理论指导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种白菜育性相关基因BCMF6及其分离方法。 本专利技术提供的白菜育性相关基因BCMF6，其特征在于具有SEQ ID No.1的序列；包含3个内含子和4个外显子，内含子的长度依次为81bp、95bp和127bp；最大ORF从第115位碱基开始，1308位碱基终止，1194个碱基编码398个氨基酸，该氨基酸具有SEQ ID No.5的序列。 本专利技术提供的白菜育性相关基因BCMF6的分离方法，其特征在于包括以下步骤1)可育株系特异BCMF-A4T17基因片段的获得设计两条AFLP引物A4和T17，用A4和T17引物对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，将能在可育株系的中蕾、大蕾和开放花中特异表达，而在不育株系中完全不表达的基因片段命名为BCMF-A4T17；2)将差异片段BCMF-A4T17进行回收、克隆和测序，得到大小为357bp，具有SEQID No.2序列的BCMF-A4T17基因片段；3)根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP1和SP2，将SP1和SP2分别与3’RACE锚定引物进行配合，以反转录的可育中蕾的双链cDNA为模板进行巢式PCR扩增，获得与BCMF-A4T17片段相关基因的cDNA的3’末端序列，该序列具有SEQ ID No.3的序列；4)根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP3和SP4，将SP3和SP4与5’RACE锚定引物通过嵌套式PCR进行扩增，获得与BCMF-A4T17片段相关基因的cDNA的5’末端序列，该序列具有SEQ ID No.4序列；5)将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A4T17片段相关基因的全长序列，基因全长为1514bp，并将其命名为BCMF6基因，该基因具有SEQ ID No.1的序列。 本专利技术步骤1)中，所设计的引物A4GAC TGC GTA CCTAAT GG；T17GAT GAG TCCAGA CCG ACA。 本专利技术步骤3)中，所设计的特异引物SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT ACA ACA ACC GTG GAC CAG G-3’。 本专利技术步骤4)中，所设计的特异引物SP35’-GAC TCC AAC ACT CCT TCC CAC-3’；SP45’-CGT CAA AGA TAC CAC CTC C-3’。 本专利技术的有益效果在于从白菜中获得了一个新的多聚半乳糖醛酸酶基因，表达分析表明其与花粉的育性决定存在密切的关系，其在花粉发育的晚期即花粉成熟和萌发过程中起作用。对其功能的转基因研究表明，其表达与花药的绒毡层存在密切的联系，且其表达模式可能是配子体表达模式。当其表达受到抑制时花粉数量减少，花粉发育异常，花粉萌发率降低，花粉畸形。这对理解多聚半乳糖醛酸酶基因在花粉发育和花粉育性决定过程中所起的作用有重要的参考价值，并为人工创造雄性不育系提供了理论依据。附图说明图1是BCMF6在pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6菜心转基因KanR植株开放花表达情况的northern杂交检测；图2是BcMF6反义载体菜心转基因植株花器官与非转基因对照花器官的比较，其中A图和B图为BcMF6基因反义载体转基因植株花器官；C为非转基因菜心的花器官；D为反义载体转基因植株花器官和对照花器官的比较；图3是BcMF6菜心转基因植株的花粉萌发，其中A，pBI35S-AMF6(×160)；B，pBIA9-AMF6(×160)；C，35S-pBI121空载体(×160)；D，A9-pBI121空载体(×160)；图4是BcMF6反义载体菜心转基因植株花粉的环境电镜扫描观察，其中A，pBI35S-AMF6(×1000)；B，pBIA9-AMF6(×1000)；C，35S-pBI121空载体(×500)；D，A9-pBI121空载体(×500)。具体实施方式1.白菜育性相关基因BCMF6的分离方法，包括以下步骤 1)可育株系特异BCMF-A4T17基因片段的获得设计两条AFLP引物A4和T17，用AFLP引物A4和T17组合对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，其中将能在可育株系的中蕾、大蕾和开放花中特异表达，而在不育株系中完全不表达的基因片段命名为BCMF-A4T17。其中A4GAC TGCGTA CCT AAT GG；T17GAT GAG TCC AGA CCG ACA；2)BCMF-A4T17基因片段的回收、克隆与测序用针尖将上述BCMF-A4T17特异条带挑一点作为模板进行PCR扩增，引物为A4和T17；PCR产物电泳检测表明，BCMF-A4T17基因片段片段长度为350 bp左右；克隆到pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，提取质粒，酶切验证并测序，结果得出该片段大小为357bp，具有SEQID No.2的序列，将该重组质粒命名为pBCMF-A4T17；3)与BCMF-A4T17片段相关的基因的cDNA的3’末端的获得根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP1和SP2，其中，SP1引物最后一个碱基与SP2引物的第一个碱基相差75个碱基，以3’RACE锚定引物分别与SP1和SP2组合，以反转录的可育中蕾的双链cDNA为模板进行巢式PCR扩增，电泳结果表明，第二轮产物分子量低于第一轮产物分子量，第二轮PCR产物的长度为1000bp左右，回收3’RACE第二轮PCR的电泳条带，克隆到pGEM-T Easy载体并测序，结果表明3’RACE扩增产物的序列长度为980bp，去掉3’RACE锚定引物20bp，实际扩增到960bp，其中含有25个T的寡聚核苷酸序。获得的BCMF-A4T17片段相关的基因的cDNA的3’末端具有SEQ ID No.3的序列。其中SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
白菜育性相关基因ＢＣＭＦ６，其特征在于：具有ＳＥＱＩＤＮｏ．１的序列；包含３个内含子和４个外显子，内含子的长度依次为８１ｂｐ、９５ｂｐ和１２７ｂｐ；最大ＯＲＦ从第１１５位碱基开始，１３０８位碱基终止，１１９４个碱基编码３９８个氨基酸 ，该氨基酸具有ＳＥＱＩＤＮｏ．５的序列。

【技术特征摘要】
的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。 序列信息<110>浙江大学<120>白菜育性相关基因BcMF6及其分离方法<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1514<212>DNA<213>Brassica sp. <400>1ataaataaga aaaatatttt ttttcaaata ctaataataa taaaactagt ggattacaaa 60atatataaac aaaaataata attgtaatcc ccagtaacta aaaaaaatca tataatgggt 120gtacattttg gaatatccgt attatttgtt gtttgtttgc taggtttatc agcaaatgct 180aaagatttca caatcactgc tcctccaggt tctgatatcg ccagcttatt gttgaaagca 240ttcaatgagg catgccagtt cccgaccagg agtagcgtat tgatccctaa aggtgaatac 300aagcttcggc aaatagagat gatgggtcca tgcaaagctc ccataaggat tactcttcaa 360ggcactgtga aagctgacgg aaacgttaac gggaatgact actgggtcgc tttccgcagg 420attaatgggt ttaagttgaa cggaggtggt atctttgacg gtgaaggtaa cgctgcatgg 480agggctaata attgccacaa aatggcatta actcagtgca agaaactccc tatcagcata 540cggtttgatt tcgtgactga cgctaagata agaggcataa cctcgttgga ttcaaagaac 600ttccacatta acgcgctcgg agcaaggaac ctgacattgg aagaaatcac gatcattgcc 660cctgaagaga gacccaacac cgatggaatc cacgtgggaa ggagtgctgg agtccagatc 720atcaactcaa acatcaaaac aggagatgac tgcatctcta ttggagacgg gacgagagac 780cttcttgtcg aaagagttac atgcggtccg ggacatggaa tcagtattgg aagcctcgga 840ttatacgtga aggaggaaga cgtcactggc atcagggtcg taaactccac cctcataaac 900actgacaatg gtgtaaggat caagacatgg ccgtctgcag cttgctccac caccgcctcg 960ggtatccatt ttgagaatat tatcctcaag aacgttacca accctatcct catcgaccaa 1020gagtactgcc cctggaaccg atgcaacaag aacaaaccat caacaatcaa gctggtggac 1080 ataagcttca agtatatcag aggaacatca gggaacaaag acgccgttaa gcttttgtgc 1140agcaagggat ttccgtgcaa gaacgtgcag attggtgaca ttgacattaa gtacaccgga 1200gccgatggtc cagcgacatt ccaatgctcc aacgtatctc ccacgttgat gggaactcag 1260gtccctaaag catgtagcag cccagtgact aagctaccag gccaataaga aatctcgatg 1320cgataaccaa tacacaatct aaaatgtaca atccataatg tatgttatat tctttcattt 1380gattttgcta gtaaaatacc tattcttttt gctaaagatg cgttttgcta gctatatttg 1440tatacatgca gcatctgaga aaaaatataa taattgttaa ctaagtacta aaaaaaaaaa 1500aaaaaaaaaa aaaa 1514<210>2<211>357<212>DNA<213>Brassica sp. <400>2gtttaagttg aacggaggtg gtatctttga cggtgaaggt aacgctgcat ggagggctaa 60taattgccac aaaatggcat taactcagtg caagaaactc cctatcagca tacggtttga 120tttcgtgact gacgctaaga taagaggcat aacctcgttg gattcaaaga acttccacat 180taacgtgctc ggagcaagga acatgacatt ggaagaaatc acgatcattg cccctgaaga 240gagtcccaac accgatggaa tccacgtggg aaggagtgtt ggagtccaga tcatcaactc 300aaacatcaaa acaggagatg actgcatctc tattggagac gggacgagag accttct 357<210>3<211>980<212>DNA<213>Brassica sp. <400>3cgtgactgac gctaagataa gaggcataac ctcgttggat tcaaagaact tccacattaa 60cgcgctcgga gcaaggaacc tgacattgga agaaatcacg atcattgccc ctgaagagag 120acccaacacc gatggaatcc acgtgggaag gagtgctgga gtccagatca tcaactcaaa 180catcaaaaca ggagatgact gcatctctat tggagacggg acgagagacc ttcttgtcga 240aagagttaca tgcggtccgg gacatggaat cagtattgga agcctcggat tatacgtgaa 300ggaggaagac gtcactggca tcagggtcgt aaactccacc ctcataaaca ctgacaatgg 360 tgtaaggatc aagacatggc cgtctgcagc ttgctccacc accgcctcgg gtatccattt 420tgagaatatt atcctcaaga acgttaccaa ccctatcctc atcgaccaag agtactgccc 480ctggaaccga tgcaacaaga acaaaccatc aacaatcaag ctggtggaca taagcttcaa 540gtatatcaga ggaacatcag ggaacaaaga cgccgttaag cttttgtgca gcaagggatt 600tccgtgcaag aacgtgcaga ttggtgacat tgacattaag tacaccggag ccgatggtcc 660agcgacattc caatgctcca acgtatctcc cacgttgatg ggaactcagg tccctaaagc 720atgtagcagc ccagtgacta agctaccagg ccaataagaa atctcgatgc gataaccaat 780acacaatcta aaatgtacaa tccataatgt atgttatatt ctttcatttg attttgctag 840taaaatacct attctttttg ctaaagatgc gttttgctag ctatatttgt atacatgcag 900catctgagaa aaaatataat aattgttaac taagtactaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960aaacatgtcc gcctcggcct 980<210>4<211>501<212>DNA<213>Brassica sp. <400>4aagcagttgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg gataaataag aaaaatattt 60tttttcaaat actaataata ataaaactag tggattacaa aatatataaa caaaaataat 120aattgtaatc cccagtaact aaaaaaaatc atataatggg tgtacatttt ggaatatccg 180tattatttgt tgtttgtttg ctaggtttat cagcaaatgc taaagatttc acaatcactg 240ctcctccagg ttctgatatc gccagcttat tgttgaaagc attcaatgag gcatgccagt 300tcccgaccag gagtagcgta ttgatcccta aaggtgaata caagcttcgg caaatagaga 360tgatgggtcc atgcaaagct cccataagga ttactcttca aggcactgtg aaagctgacg 420gaaacgttaa cgggaatgac tactgggtcg ctttccgcag gattaatggg tttaagttga 480acggaggtgg tatctttgac g 501<210>5<211>397<212>PRT<213>Brassica sp. <400>5 Met Gly Val His Phe Gly Ile Ser Val Leu Phe Val Val Cys Leu Leu1 5 10 15Gly Leu Ser Ala Asn Ala Lys Asp Phe Thr Ile Thr Ala Pro Pro Gly20 25 30Ser Asp Ile Ala Ser Leu Leu Leu Lys Ala Phe Asn Glu Ala Cys Gln35 40 45Phe Pro Thr Arg Ser Ser Val Leu Ile Pro Lys Gly Glu Tyr Lys Leu50 55 60Arg Gln Ile Glu Met Met Gly Pro Cys Lys Ala Pro Ile Arg Ile Thr65 70 75 80Leu Gln Gly Thr Val Lys Ala A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张强，曹家树，黄鹂，余小林，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]