本发明专利技术公开了白菜花粉外壁蛋白基因ＢｃＭＦ５的启动子及其分离方法。利用ＴＡＩＬ－ＰＣＲ方法从中国普通白菜中克隆了一个新的花粉外壁蛋白ＢｃＭＦ５基因的启动子。序列分析表明，在其正向链和反向互补链都预测到一个启动子区域，并含有多个花粉特异表达的保守元件和一些环境响应元件。对启动子的功能分析表明其正反两个方向都有驱动ＧＵＳ基因在花粉中表达的能力。因此ＢｃＭＦ５启动子是一个能在花粉中表达并可能受环境诱导表达的双向启动子。这对阐明花粉外壁蛋白基因在花粉和柱头互作及自交不亲和反应的花粉识别中所起的作用有重要意义，并在基因工程领域具有潜在的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物
技术介绍
近年来，TAIL-PCR方法被广泛用于扩增T-DNA插入位点两端的侧翼序列，但用于克隆启动子序列的报道还比较少，在山药(Dioscorea)中已有成功的报道，证明TAIL-PCR用来扩增基因的启动子序列是切实可行的。花粉外壁蛋白(PCPs-pollen coat proteins)是一些小的、配子体表达、高度多态性的富含半胱氨酸的小分子巯基蛋白，属于一个大的基因家族。PCPs在芸薹属植物自交不亲合和植物有性生殖中花粉和柱头的黏附过程中起重要的作用。PCP-A类花粉外壁蛋白(pollen coat protein，class A)是迄今为止分离的唯一在花粉和柱头互作和花粉识别中起关键作用的一类花粉外壁蛋白基因。为了阐明BcMF5基因在育性决定、芸薹属植物SI反应和植物有性生殖中花粉和柱头的黏附过程的作用，有必要分离其启动子序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。 本专利技术提供的白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5的启动子具有SEQ ID No.1的序列，在其正向链和反向互补链都预测到一个启动子区域，在其序列中有多个花粉特异表达的保守元件及一些环境响应元件。 本专利技术提供的白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5启动子的分离方法，包括以下步骤1)根据BcMF5的cDNA扩增序列设计3个反向引物，A15′-TTTGGCACATTGGGCTTTA-3′、A25′-GGCACATTGGGCTTTACATT-3′和A35′-GACAATTAAGCGATGATCGATA-3′；2)分别用3个简并引物AD1、AD2和AD3与BcMF5基因的特异引物A1结合进行TAIL-PCR的第一轮扩增，其中AD15′-NGTCGASWGANAWGAA-3′、AD25′-TGWGNAGSANCASAGA-3′、AD35′-AGWGNAGWANCAWAGG-3′；3)将第一轮的PCR产物稀释20倍，用作第二轮反应的模板，再分别用简并引物AD1、AD2和AD3与特异引物A2结合进行TAIL-PCR的第二轮扩增；4)将第二轮的PCR产物稀释10倍，用作第三轮反应的模板，再分别用简并引物AD1、AD2和AD3与特异引物A3结合进行TAIL-PCR的第三轮扩增；5)将简并引物AD2与特异引物A3结合扩增出的大小大约为650-bp的特异条带，回收、连接、转化大肠杆菌并测序； 6)对克隆得到的启动子序列用Blast软件在GENEBANK数据库上作同源搜索进行同源性分析，没有发现其同源启动子序列，确认得到的是新的白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5启动子。 上述的第一轮TAIL-PCR反应程序为92℃3min，95℃1min，1个循环；94℃30s，50℃1min，72℃30s，5个循环；94℃30s，25℃3min，3min内退火温度升到72℃，72℃2min，1个循环；94℃30s，40℃1min，72℃2min，94℃30s，40℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，10个循环。 第二轮TAIL-PCR反应程序为94℃30s，50℃1min，72℃2min，94℃30s，50℃1min，72℃2min，10个循环；94℃30s，40℃1min，72℃2min，72℃5min，1个循环。 第三轮TAIL-PCR反应程序为94℃30s，40℃1min，72℃2min，20个循环；72℃5min，1个循环。 本专利技术的有益效果在于本专利技术提供的白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5的启动子是一个能在花粉中表达并可能受环境诱导表达的双向启动子，目前还没有见到类似报道，说明这是一个新的花粉外壁蛋白基因的启动子。这为研究花粉外壁蛋白基因启动子的启动功能和鉴定其特有的序列元件奠定了工作基础，对阐明花粉外壁蛋白基因在花粉和柱头互作及自交不亲和反应的花粉识别中所起作用有重要意义，并在基因工程领域具有潜在的应用价值。附图说明图1是BcMF5基因启动子与GUS基因的融合表达载体菜心转化植株花粉的GUS染色情况，其中A图是非转化菜心植株花粉的GUS染色(×320)；B图是启动子612bp正向链与与GUS基因的融合表达载体的菜心转化植株花粉的GUS染色(×640)；C图是启动子612bp反向互补链与GUS基因的融合表达载体的菜心转化植株花粉的GUS染色(×320)。具体实施方式1.白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5启动子的分离方法，步骤如下1)根据BcMF5的cDNA扩增序列设计3个反向引物，A15′-TTTGGCACATTGGGCTTTA-3′、A25′-GGCACATTGGGCTTTACATT-3′和A35′-GACAATTAAGCGATGATCGATA-3′；2)分别用3个简并引物AD1、AD2和AD3与BcMF5基因的特异引物A1结合进行TAIL-PCR的第一轮扩增，其中AD15′-NGTCGASWGANAWGAA-3′、AD25′-TGWGNAGSANCASAGA-3′、AD35′-AGWGNAGWANCAWAGG-3′；第一轮PCR反应程序为92℃3min，95℃1min，1个循环；94℃30s，50℃1min，72℃30s，5个循环；94℃30s，25℃3min，3min内退火温度升到72℃，72℃2min，1个循环；94℃30s，40℃1min，72℃2min，94℃30s，40℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，10个循环。 3)将第一轮的PCR产物稀释20倍，用作第二轮反应的模板，再分别用简并引物AD1、AD2和AD3与特异引物A2结合进行TAIL-PCR的第二轮扩增；第二轮PCR反应程序为94℃30s，50℃1min，72℃2min，94℃30s，50℃1min，72℃2min，10个循环；94℃30s，40℃1min，72℃2min，72℃5min，1个循环。 4)将第二轮的PCR产物稀释10倍，用作第三轮反应的模板，再分别用简并引物AD1、AD2和AD3与特异引物A3结合进行TAIL-PCR的第三轮扩增；第三轮PCR反应程序为94℃30s，40℃1min，72℃2min，20个循环；72℃5min，1个循环。 5)将TAIL-PCR的第二轮和第三轮产物用1.2％的琼脂糖电泳分离，在TAIL-PCR第三轮反应中简并引物AD2与特异引物A3结合扩增出650-bp左右的特异条带。用VITAGENE公司的DNA凝胶回收试剂盒回收此片段，连接到pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)、转化大肠杆菌、蓝白斑筛选阳性克隆、碱裂解法抽提质粒，用EcoR I进行单酶切鉴定和PCR鉴定后，重组质粒送上海博亚生物公司测序。 6)测序结果表明，其长度为654bp，具有SEQ ID No.1的序列。此序列与BcMF5序列重叠的碱基数是64bp，实际向上扩增了568bp，这样起始密码子ATG上游的5’-UTR长度就是620bp。对BcMF5基因的碱基组成进行分析，发现碱基A、G、T、C所占比例依次是34.82％，12.54％，41.91％，10.73％；A+T的比例为76.73％，C+G的比例为23.27％，符合启动子的碱基组成。对ATG本文档来自技高网...
【技术保护点】
白菜花粉外壁蛋白基因ＢｃＭＦ５的启动子，其特征在于，它具有ＳＥＱＩＤＮｏ．１的序列。
【技术特征摘要】
的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。 SEQ ID No.1的信息<110>浙江大学<120>白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5的启动子及其分离方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>605<212>DNA <213>cabbage leaf curl virus<400>1aaactcaaag gactaatgca gtgttggttt agtgcaaggc agceatagga ataactaggt 60ttcatagttt gagttatgat agaattcttt agttattggt gtacataaac attctttttc 120ctgatgatca ataaatttaa catttcatca aaagaaaaaa tattaataat tttgttggtg 180attgttgtgt aataaggtgt actagattac taaataaaaa taacaaattt gcatgtttct 240gtcttattgt acaataacat tttacatttt atttttcggt ttctttttta actaggtatt 300gtataaattt tgaatttgtg acttcataga atttgatttc ttatgtatat cgataaatat 360tttcaaaaaa aatttaaaat aaatgagtca aactttttat ctattaaata aataaaatta 420gaattttgat tttttttggg tcaaactaga tccttatatt ttggcatttt taacgccact 480taacttaatt tagatatatt taattttgtg attgatctat aaatatactt ctcggtcttc 540cttaattttt aaacactatc agtttattat ttaatttatt ctgtcagaaa atacaaaaaa 600ataag 605权利要求1.白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5...
【专利技术属性】
技术研发人员：张强，曹家树，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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