白菜花粉壁发育相关基因PGBc2及其分离方法技术

本发明专利技术公开了一种白菜花粉壁发育相关基因ＰＧＢｃ２及其分离方法，白菜花粉壁发育相关基因ＰＧＢｃ２包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．２所示的核苷酸序列，该基因的分离克隆及功能验证，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育产生的分子机理，对生产上人为控制植物育性，培育优良品种具有重要的实践意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种白菜花粉壁发育相关基因PG5c2及其分离方法。
技术介绍
花粉发育与植物雄性不育密切相关，同时是研究细胞生长、分裂、细胞分 化和细胞间信息传递等过程的理想模型。因此，花粉发育研究一直是生命科学 研究领域中的热点。花粉发育过程复杂，涉及众多基因的表达调控。研究发现 花粉基因表达的一大特点就是表达大量与细胞壁合成、调控相关的基因。花粉 粒最具特色的一部分是花粉壁(Blackmore and Barnes, 1990; Owen andMakaroff, 1995)。由花粉外壁和花粉内壁两层组成，在花粉发挥正常功能上起 着举足轻重的作用，尤其是在花粉萌发和花粉管生长过程中，花粉壁的异常是 导致花粉不能完成其生物学功能的主要原因之一。关于作用于花粉壁发育的基因或蛋白质目前研究不多，在模式生物拟南芥 中，只发现了数个花粉外壁发育的异常的突变体，例如迈s么/7p入"e/7和^;^， 以及2个花粉外壁和内壁同时异常的突变体迈s3滩/^7。这些突变体对应的基因 所编码的蛋白质功能均未完全明确(Aarts eta7, 1997; Paxson-Sowders "a7， 1997， 2001; Shukla et a7. ， 1998; Fei and Sawhney， 2001; Ariizumi et a7， 2003， 2005)。在白菜中尚未有作用于花粉壁发育的基因或突变体被分离的报 导。花粉萌发时的水合花粉会释放很多存在于花粉壁中的蛋白质，或者从花粉 内部分泌一些蛋白质，这些蛋白质被认为是花粉壁或花粉管壁发育所必需的 (Cosgrove eta7， 1997, 2000; Allen eta7， 1993)，多聚半乳糖醛酸酶(PG)就是其中之一。它是一种细胞壁水解和疏松酶，参与果胶的降解，使细胞壁结 构解体。尽管目前的研究推测花粉管中的PG可能通过降解花柱细胞壁而允许花 粉管通过花柱，或者可能作用于本身的细胞壁而加速自身的生长(Brown1990; Allen " a7， 1993; Hadfield " <a7, 1998; Honys " a二 2003)。但 是，确切证据却少之又少。因此，花粉壁发育相关的基因的克隆和功能鉴定仍 然是一项重要的工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供了一种白菜花粉壁发 育相关的基因/^^^及其分离方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的-一种白菜花粉壁发育相关基因尸6及么它包含SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。进一步地，还包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入 或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。一种权利要求1所述的白菜花粉壁发育相关基因/^^2的分离方法，包括以下步骤(1) 、用A8/T18引物对 <矮脚黄'白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育 株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，获得在可育株系花蕾中特异表 达的基因片段Bc-A8T18，该片段包含SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列和在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成 的衍生物；(2) 、利用RACE技术扩增Bc-A8T18片段相关的基因的cDNA的3'末端和5' 末端，其中，正向特异引物S1序列为5' -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3，； 反向特异引物A1序列为5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3，；分别与3' RACE和 5' RACE锚定引物扩增3'末端和5'末端；(3) 、用常规PCR扩增Bc-A8T18片段相关基因的cDNA序列及其DNA序列，该 DNA序列即为SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。根据两端拼接的cDNA全长序 列设计特异引物Tl和T2，从花蕾cDNA中扩增Be-A8T18片段相关基因的cDNA 序列，从基因组DNA中扩增其DNA序列。Tl和T2的序列分别为Tl, 5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3' ; T2， 5' -AGAGCATACATCATAGAC-3，。本专利技术的有益效果是本专利技术采用cDNA-AFLP技术对'矮脚黄'白菜核不 育两用系的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行分析，同时配合RACE技术分离获得与花粉壁发育相关基因为进一步弄清不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物花粉壁发育和雄性不育发生的分子机制提供研究基 础，进而为人工创建不育材料、培育优良品种提供物质条件。附图说明图1是白菜尸6^W cDNA和DNA全长序列的扩增图； 图2为推测的白菜尸6^^氨基酸序列图； 图3为白菜尸6^^的时空表达特点示意图； 图4为白菜尸6^^表达的原位杂交分析图；图5为反义/^^2基因表达载体示意图；图6为Northern杂交检测户6^^在转基因菜心中的表达示意图; 图7转反义/^^^基因菜心的花粉离体萌发观察图；图8转反义/^ft^基因菜心花粉扫描电镜观察图；图9转反义/^A^基因菜心花粉发育透射电镜观察图。具体实施方式本专利技术通过基因表达差异分析从白菜^力^5" Wca^^7-W力S'的可育株 系花蕾中分离得到一个可育花蕾特异表达的基因尸"万c么序列分析表明该基因 具有植物PG基因家族的4个保守结构域，并与已知的PG基因具有较高的相似 性，但不同于已知的PG基因家族成员，因此为一个新的PG基因。RT-PCR、 Northern杂交及原位杂交表明，凡Wc2的转录本最早在白菜花药四分体时期的 绒毡层和四分小孢子中出现，且在绒毡层中的表达量要比在四分小孢子中的表 达量高。随后在绒毡层中一直维持很强的表达信号，直到绒毡层的降解退化， 在小孢子中的表达水平从单核小孢子时期开始增强， 一直持续到花粉成熟期。 通过反义RNA技术，将尸6^^的反义基因导入正常可育的白菜细胞，验证了该基因的功能。发现/^&^表达受抑制或沉默的转基因植株花粉因花粉壁发育的 受阻导致花粉不能正常萌发，植株雄性育性降低，表明/^ft^为一个重要的花 粉壁发育相关基因。该基因的分离克隆，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育 分子机理，对生产上人为控制植物育性，培育优良品种具有重要的实践意义。 实现本专利技术的具体技术步骤如下1. 白菜/^5ci"基因的分离和序列分析利用cDNA-AFLP技术分析白菜'Aa力W-^M/W的不育株系与可 育株系花蕾基因表达差异，筛选到A8/T18引物扩增得到的在可育株系花蕾中 特异表达的基因片段Bc-A8T18，长250 bp，具体序列见SEQ ID No. 1。通过 RACE技术扩增得到该片段相关基因的cDNA的3'末端，2次扩增结果均显示 目的片段大小约为1 400bp，如图1A泳道1、2所示；3' RAGE产物克隆至pGEM-T Easy载体，转化DH 5d感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质 粒，酶切鉴定'(图1B)后测序。类似地，通过RACE技术扩增得到该片段相关 基因的cDNA的5'末端(图1C泳道1、 2)，经克隆后酶切鉴定(图1C泳道3、 4)再测序。根据两端拼接的cDNA全长序列设计引物，常规PCR方法扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白菜花粉壁发育相关基因ＰＧＢｃ２，其特征在于：它包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．２所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹂，曹家树，叶意群，张豫超，张爱红，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]