不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法技术

本发明专利技术提供了不结球白菜高Ｖｃ含量基因的分子标记方法，属于分子遗传学领域。对不结球白菜高Ｖｃ含量品种’常州乌塌菜’和低Ｖｃ含量品种‘二青’进行ＲＡＰＤ分子标记的筛选，获得与不结球白菜高Ｖｃ含量基因连锁的一个标记ＡＷ５↓［５６１］，对该特异片段进行测序分析，并将其转化为稳定的ＳＣＡＲ标记，即ＳＣＡＷ５↓［５３２］。通过本发明专利技术提供的分子标记，可有效开展不结球白菜高Ｖｃ含量品种的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于分子生物学领域， 涉及不结球白菜高Vc含量系的分子育种，专用于不结球白菜高Vc含量品种的筛选 和鉴定。二
技术介绍
不结球白菜(_Srow/ca cawjpeWriy.ssp. cA/"e"siy. Makino)又名小白菜、青菜、油 菜，是我国长江中下游及其以南地区的一种四季栽培的蔬菜，近年来在我国北方也 有较大面积的引种栽培和推广。近年来，人们对蔬菜品质的要求越来越高，而Vc 是品质性状中的重要指标，因此，高Vc含量成为不结球白菜的重要育种目标。张增翠等采用主基因一多基因混合遗传模型分析方法，对不结球白菜常州乌塌菜X矮脚黄、雪克青X矮脚黄两个组合的Vc、可溶性糖含量进行单世代和联合世代 遗传分析。结果表明，两组合中Vc含量遗传符合一个主基因和多基因的混合遗传模 型，主基因遗传率为52.68% 74.12%。 Rousseaux禾卩Sxhauer发现了番茄中控制果 实Vc含量的QTL (Rousseaux et al., 2005; Schauer et al.， 2006)。RAPD标记已广泛应用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测及 目标性状分子标记筛选等领域。本专利技术采用BSA方法和RAPD技术，筛选与不结球 白菜高Vc含量基因紧密连锁的标记，以实现不结球白菜高Vc含量性状的标记辅助 育种，加速我国不结球白菜高Vc含量品种的选育进程。三
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是:筛选出一个或几个与不结球白菜高VC含量基因紧 密连锁的分子标记，这些分子标记用于不结球白菜辅助选择育种和品种鉴定，可大 大提高不结球白菜高VC含量品种的选择鉴定效率。技术方案本专利技术的实施方案如下 不结球白菜高VC含量基因的分子标记方法，其特征在于用RAPD标记引物AW5: CTGCTTCGAG扩增不结球白菜DNA，如果能够扩出561bp的片段AW5561，则标志着不结球 白菜高Vc含量基因的存在；或者用SCAW标记引物SCAW5532 F: TTCGAGGCTGAAGAG R: TTTCGCGTCTACTAATGC扩增不结球白菜DNA，如果能够扩出532bp的片段SCAW5532,则标志着不结 球白菜高Vc含量基因的存在。有益效果本专利技术选用的是不结球白菜高Vc含量品种常州乌塌菜和低Vc含量 品种二青为材料开展不结球白菜高Vc含量基因分子标记的筛选。与目前技术相比， 其优点是(1) RAPD操作简便、快速、方便，它可以直接对生物基因组DNA多态性进 行分析，RAPD引物的设计是随机的，因而无须知道特异位点序列的信息。(2) SCAR将退火温度提高到50 6(TC,既克服了RAPD的不稳定性，又具有 简单、实用、成本低的优点。(3) 辅助选择方便，节约成本。不结球白菜高Vc含量品种的常规选育方法周 期长，成本高，费时又费力。通过本专利技术筛选出的与不结球白菜高Vc含量基因紧密 连锁的分子标记用于辅助选择，可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球 白菜高Vc含量系的选择效率，从而加快育种进程。(4) 本专利技术提供的分子标记，生产上可用于对不结球白菜高Vc含量品种的纯 度鉴定。四附图说明图l父母本及F,、 F2代DNA的提取泳道1 3分别为W、 Q、 F。泳道4-6为F2单株。 图2高、低Vc含量基因池、亲本的多态性筛选M为DL2000marker，—代表高、低池间的差异条带。 图3特异引物的扩增结果M为DL2000marker， W为母本，Q为父本，H为高Vc含量基因池L为低Vc 含量基因池。图4连锁标记对高、低Vc含量基因池，父母本，F2代单株的扩增结果M为DL2000marker， W为母本，Q为父本，H为高Vc含量基因池，L为低Vc含量基因池。l-6为高Vc含量单株，8-13为低Vc含量单株。 图5SCAR标记对高、低Vc含量基因池，父母本，F2代单株的扩增结果M为DL2000marker， W为母本，Q为父本，H为高Vc含量基因池L为低Vc 含量基因池，l-7为高Vc含量单株，8-13为低Vc含量单株。 图6标记AW5561与高Vc含量基因的连锁图五具体实施例方式利用RAPD等分子标记技术寻找与高Vc含量基因连锁的标记，为定位及克隆 这些基因提供了极其有用的工具，并为分子标记辅助育种打下良好的基础。分子标 记辅助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程。 目前国内外未见在不结球白菜高Vc含量基因分子标记方面的报道。 本专利技术的实施程序是(一)材料与方法材料选用不结球白菜高Vc含量品种常州乌塌菜和低Vc 含量品种二青(均为公知公用材料，见参考文献宋玉萍等不结球白菜维生素C积累 与相关酶活性研究，西北植物学报，2007, 27(11))。高Vc含量品种常州乌塌菜、低 Vc含量品种二青和杂交代及自交F2代进行Vc含量测定、分子标记的筛选及连锁 分析。(二)杂交F2后代Vc含量的分组和遗传分析常州乌塌菜和二青杂种F,自交获得了F2群体。测定F2个体Vc含量后从低到高依次排列，以每百克相差4亳克为一组(表l)，如以0-26 (mg/100g)、 26-34 (mg/100g)和34-42 (mg/100g)分为三个Vc含量组，则低Vc含量株有12+36-48株，高Vc含量株有61+38+20+14=133株，x2=0.2231<3.84，符合3: l分离比，表明控制不结球白菜Vc含量基因中存在单一位点的主效基因。进一步分析，可将高Vc含量组中分为两组即中Vc含量组中有61+38-99株，乂2 = 3.76<3.84符合1: 2: 1。说明白菜高Vc含量基因中可能存在一个类似于质量性状的显性主效基因。表l<table>table see original document page 5</table(三)分子标记分析主要利用RAPD标记。 采用CTAB法(见参考文献M.G.Murray,W.F.Thompson. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research, 1980, 8(19): 4321~4325),提取 (提取方法见参考文献史公军，侯喜林.不结球白菜RAPD反应体系的优化.江西农 业大学学报，2004, 26(1): 1~5)高Vc含量品种常州乌塌菜和低Vc含量品种二青及 F2的单株DNA (见图1)。首先用512个特异RAPD引物(由上海英骏生物技术有限公司合成)对不结球 白菜的父母本、高低池DNA多态性进行初步分析。PCR反应体系为在25pL反应 体系中，1.9nLdNTP(2.5mmol/L)， 2pLMg2+(10腿o1/L)， 0.2pLTaqE ( 5 U尔L)， lpL DNA( 25 ng尔L)， lpL 50%甘油，lpL Primer (lO^mol/ L)， 2.5pL 10x Buffer, 13pL H20。 PCR扩增程序为94。C变性2min， 37。C退火30s， 72。C延伸50s， 2个循环； 94。C变性45s， 37。C退火30s， 72。C延伸50s， 72。C延伸5min， 18个循环；94。本文档来自技高网...

【技术保护点】
不结球白菜高Ｖｃ含量基因的分子标记方法，其特征在于　用ＲＡＰＤ标记引物ＡＷ５：ＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧ　扩增不结球白菜ＤＮＡ，如果能够扩出５６１ｂｐ的片段ＡＷ５↓［５６１］，则标志着不结球白菜高Ｖｃ含量基因的存在；　或者用ＳＣＡＷ标记引物ＳＣＡＷ５↓［５３２］　Ｆ：ＴＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧ　Ｒ：ＴＴＴＣＧＣＧＴＣＴＡＣＴＡＡＴＧＣ，　扩增不结球白菜ＤＮＡ，如果能够扩出５３２ｂｐ的片段ＳＣＡＷ５↓［５３２］，则标志着不结球白菜高Ｖｃ含量基因的存在。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李英，单晓政，侯喜林，王建军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]