体外筛选2′-取代核酸的方法技术

对应靶分子识别含有修饰核苷酸的核酸配体的方法，其中包括：　　　　ａ）制备转录反应混合物，其中包括变异聚合酶、一种或者多种２’－修饰三磷酸核苷（ＮＴＰｓ）、镁离子、和一种或者多种低核苷酸转录模板；　　　　ｂ）通过在一定条件下转录一种或者多种低核苷酸转录模板，制备单链核酸的候选混合物，由此变异聚合酶将至少一种或者多种核苷酸嵌入所述候选混合物的每一种核酸，其中所述候选混合物的每种核酸包括选自２’－位置修饰嘧啶与２’－位置修饰嘌呤的２’－修饰核苷酸；　　　　ｃ）将候选混合物与所述的靶分子相接触；　　　　ｄ）从剩余的候选混合物分离出相对于候选混合物与靶分子亲合性增强的核酸；　　　　ｅ）在生命体外扩增亲合性增强的核酸，产生富含配体的核酸混合物，由此识别出靶分子的核酸配体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及核酸领域，更具体地讲，本专利技术涉及适体、以及筛选嵌入修饰核苷酸适体的方法。本专利技术还涉及酶促生成含有修饰核苷酸的随机低核苷酸库的材料与方法，例如从上述库中筛选出对应特定靶的适体。
技术介绍
适体是通过相互作用而不是经典的沃森-克里克碱基配对、对于分子具有特异性结合亲合性的核酸分子。适体，如噬菌体展示或者单克隆抗体(MAbs)生成的胎，能够特异性结合选择靶，并且通过结合阻止靶自身作用的发挥。采用从随机序列低核苷酸库中(附图说明图1)生命体外筛选方法，已经生成了对应超过100种蛋白的适体，其中包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白、和受体。常规的适体尺寸在10-15KDa(30-45个核苷酸)，利用亚纳摩尔亲合性结合靶，并排斥相近的靶(例如，通常不与相同基因族的其它蛋白结合)。一系列的结构研究显示，适体可以利用在抗体-抗原复合体中产生亲合性与特异性的相同类型结合的相互作用(氢键结合、静电互补、疏水性连接、空间排斥等)。作为治疗剂(和诊断剂)使用时，适体具有许多令人满意的特性，其中包括强特异性与亲合性，生物学效能、和优秀的药物方法制备适体，允许迅速生成初始(治疗)前导物。生命体外筛选允许紧密控制适体的特异性与亲合性，并且允许产生对应毒性靶和非致免疫靶的前导物。(1)毒性与免疫原性经证实，作为一类物质适体具有微弱的毒性或者免疫原性、或者不具有毒性动力学特性。此外，与抗体与其它蛋白生物制剂相比适体提供了特异性竞争优势，例如(2)速度与控制可以采用完全生命体外与免疫原性。使用高含量的适体慢性给药鼠或者旱獭(每天10毫克/千克，持续90天)，采用任何临床、细胞、或者生化方法，未能观察出毒性。鉴于许多单克隆抗体的效能严格受限于对应自身抗体的免疫响应，因此对应适体引发抗体是极困难的(最大可能是因为由T细胞通过主要组织相容性复合体不能产生适体，并且通常免疫响应不能受训识别核酸片段)。(3)给药鉴于当前批准的所有抗体治疗剂都是由静脉内注射给药(通常相隔2-4小时)，然而，适体可以皮下注射给药。这种差别主要是由于相对低的可溶性，因此大部分治疗性的单克隆抗体需要大体积。由于具有良好的可溶性(＞150毫克/毫升)和相对低的分子量(适体10-50kDa；抗体150kDa)，通过注射给药的每周剂量体积小于0.5毫升。在猴子的研究中，通过皮下给药的适体生物药效率大于80％(Tucker等人，期刊《色谱法》1999年第B.732期第203-212页)。此外，适体的小尺寸可以使其渗入抗体与抗体片段无法渗入的构象收缩区域，由此展现适体治疗剂或者预防剂的另一个优点。(4)规模化与成本可以化学合成治疗性的适体，因此很容易地按照需求规模化生产。鉴于当前规模化生产中的困难限制了一些生物制剂的可用性，并且大型蛋白生产设备资本成本巨大，然而，一台大型合成机可以每年生产100多公斤低核苷酸，并且需要相对适中的初始投资。据估算，与最佳抗体的成本相比，在千克规模下当前适体合成产品成本是500美元/克。经过5年生产方法的连续改进，预计产品的生产成本会降至100美元/克以下。(5)稳定性治疗性的适体具有化学稳定性。经过暴露在加热与变性剂等环境后，适体可以内在地恢复活性，并可以在室温下以冻干粉末的形式超长储存(大于一年)。相反的是，抗体必须冷冻保存。适体作为治疗剂的上述优点一定有益于获得延长或者增加适体治疗剂在生命体外稳定性的材料与方法。本专利技术提供了满足上述需求与其它需求的材料与方法。附图简述图1是从随机序列低核苷酸库生命体外筛选适体(SELEXTM)过程的示意图。图2展示了2’-氧-甲基(2’-OMe)修饰核苷酸，其中“B”是嘌呤碱、或者嘧啶碱。图3A是三种2’-氧甲基血管内皮生长因子适体结合血管内皮生长因子的图形ARC224，ARC245和ARC259；图3B展示了上述适体的序列和推定的第二结构。图4是ARC224的各种2’-羟基G变异体与ARC225结合血管内皮因子的图形。图5是在HUVEC中ARC224结合VEGF的图形。图6是在含有与不含有EDTA的条件下热压处理前、后ARC224结合血管内皮因子的图形。图7A和7B分别是，当在37℃鼠血浆培养时，展示ARC224和ARC226稳定性的图形。图8是展示与免疫球蛋白E结合的dRmY SELEXTM第6次循环序列的图形。图9是展示与凝血因子结合的dRmY SELEXTM第6次循环序列的图形。图10是展示与血管内皮生长因子结合的dRmY SELEXTM第6次循环序列的图形。图11A是在37℃下95％鼠血浆(柠檬酸化)中所有带有3’-idT的2’-氧甲基低核苷酸的降解图，图11B是在37℃下95％鼠血浆中对应dRmY低核苷酸的降解图。图12是rGmH h-免疫球蛋白E结合克隆(第6次循环)的图形。图13A是对于rRmY库PDGF-BB筛选第12次循环库的图形，图13B是对于rGmH库PDGF-BB筛选第10次循环库的图形。图14是与IL-23结合dRmY SELEXTM第6、7、8次循环和未经筛选序列的图形。图15是与PDGF-BB结合dRmY SELEXTM第6、7次循环和未经筛选序列的图形。专利技术概述本专利技术提供了通过在促使修饰核苷酸嵌入低核苷酸的特定条件下转录生成增加稳定性低核苷酸的材料与方法。这些修饰的低核苷酸可以是，例如适体、反义分子、RNAi分子，siRNA分子、或者核糖酶。优选的是，低核苷酸是适体。在一实施方案中，本专利技术提供了使用嵌入修饰核苷酸的低核苷酸随机库的改进SELEXTM方法(“2’-氧甲基SELEXTM”)，由上述库中可以筛选出对应特定靶的适体。在一实施方案中，本专利技术提供了在特定转录条件下使用修饰酶将修饰核苷酸嵌入低核苷酸的方法。在一实施方案中，本专利技术提供了使用变异聚合酶的方法。在一实施方案中，变异聚合酶是T7 RNA聚合酶。在一实施方案中，各种转录反应条件下使用在639位置(从酪氨酸残基变成苯丙氨酸残基“Y639E”)和784位置(从组氨酸残基变成丙氨酸残基“H784A”)发生变异的修饰T7 RNA聚合酶，从而造成修饰的核苷酸嵌入本专利技术的低核苷酸。在另一实施方案中，各种转录反应条件下使用在639位置(从酪氨酸残基变成苯丙氨酸残基)发生变异的修饰T7 RNA聚合酶，从而造成修饰的核苷酸嵌入本专利技术的低核苷酸。在另一实施方案中，各种转录反应条件下使用在784位置(从组氨酸残基变成丙氨酸残基)发生变异的修饰T7 RNA聚合酶，从而造成修饰的核苷酸嵌入本专利技术的适体。在一实施方案中，本专利技术提供了通过本专利技术修饰酶增强修饰核苷酸嵌入的各种转录反应混合物。在一实施方案中，向转录反应混合物加入锰离子，通过本专利技术修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。在另一实施方案中，向转录反应混合物加入2’-羟基三磷酸鸟苷，通过本专利技术修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。在另一实施方案中，向转录反应混合物加入聚乙二醇(PEG)，通过本专利技术修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。在另一实施方案中，向转录反应混合物加入鸟苷酸(或者任何取代的鸟苷)，通过本专利技术修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。在另一实施方案中，使用在模板低核苷酸5’固定区域(优选的是长度为20-25个核苷酸)的5’末端嵌入的前导序列，通过本专利技术修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。优选的是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼·克费，查尔斯·威尔逊，波拉·伯梅斯特，萨拉切斯沃思·克内，
申请(专利权)人：阿切埃米克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：