本发明专利技术公开了一种抑制Ｓｔａｔ３基因表达的ｓｉＲＮＡ及其制备方法。抑制Ｓｔａｔ３基因表达的ｓｉＲＮＡ，该ｓｉＲＮＡ表达质粒包括：ｐＢＳ／Ｕ６载体；编码特异性抑制Ｓｔａｔ３基因表达的ｓｉＲＮＡ的ＤＮＡ片段。本发明专利技术利用ＤＮＡ介导的ＲＮＡ干扰技术构建Ｓｔａｔ３基因特异性的ＲＮＡｉ，用于观察细胞内Ｓｔａｔ３被特异性抑制的情况下信号通路的变化，从而为在细胞系中研究Ｓｔａｔ３的功能提供了有效的工具，在治疗与研究与Ｓｔａｔ３相关的肿瘤领域中有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种siRNA，特别涉及一种抑制Stat3(signal transducer andantivator of transcription信号转导及转录活化因子)基因表达的siRNA和及其制备方法。
技术介绍
RNAi(RNA interference)技术是近几年发展起来的一种抑制基因表达的新方法，该方法是将功能未知基因编码区(外显子)或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达，这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干扰，使目的基因沉默。这一现象已在植物、真菌(fungi)、锥虫(trypanosome)、涡虫(planaria)、囊虫(hydra)、果蝇(drosoph ila)、线虫(caneno rhabdit is elegans)、斑马鱼(zeb rafish)、老鼠早期胚胎等不同种属的生物体中得以发现。RNAi的外源性或内源性的dsRNA在细胞内与一种RNA酶III(RNAaseIII核酸内切酶)——Dicer结合，随即被切割成21～23nt的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA(double-stranded RNA)，是RNAi的起始诱导物，即siRNA(small interference RNA)。siRNA与Dicer形成RNA诱导沉默复合物(RNA induces silencing comple，RISC)。siRNA作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RICS结合mRNA。随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成2l～23nt的片段，特异性地抑制靶基因的表达。新产生的dsRNA片段可再次形成RISC，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。因此，每个细胞只需要几个siRNA分子就能够引起强烈的RNAi效应。此外，siRNA还可以在RNA依赖性RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRp)的作用下进行大量扩增，并转运出细胞，使RNAi扩散到整个机体并可以传代。目前RNAi技术已经广泛用于基因功能、信号转导通路方法以及肿瘤基因治疗的研究领域。RNAi识别可以精确到一个核苷酸，对由野生型点突变形成的癌基因如ras、p53等，能够产生准确有效的封闭效果，野生型基因则不受影响，可以用于阻断某些突变基因的表达，或者由蛋白过量表达引起的恶变。RNAi在肿瘤基因治疗上与基因替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统的基因治疗方法相比，具有特异、高效、毒性小的特点，因此可用来对一些肿瘤进行治疗。RNAi技术用于抑制肿瘤生长因子的表达，可以抑制动物模型的肿瘤生长，并已经应用于快速鉴别新的肿瘤靶目标。由于肿瘤是多基因、多因素疾病，单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果，RNAi技术能够同时抑制多个不同基因，而且抑制效果互不干扰。RNAi对人类宫颈癌细胞Hela、非小细胞肺H1299、头颈部鳞状细胞癌C33、骨肉瘤U22OS、乳腺癌MCF27等细胞系实验中肿瘤相关基因的抑制作用也很明显。siRNA的序列专一性非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。Stat(signal transducer and antivators of transcription)信号转导及转录活化因子)是存在于细胞质中的一类潜在的信号转导和转录激活因子。其蛋白家族有7个成员，Stat1，2，3，4，5a，5b，和6。其中的Stat3在细胞的增殖、分化、存活以及胚胎发育中都有非常重要的作用。Stat3信号通道的过度激活破坏了正常细胞的增殖、生存活动，能够诱导出某些转化细胞的特性；过表达的Stat3调节了细胞周期的控制和凋亡活动，表明Stat3的激活可能与致癌作用有关，阻断Stat3信号通路有望能够预防和治疗人类肿瘤。因此利用上述的RNAi技术来阻断Stat3信号通路可以预防和治疗人类肿瘤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抑制Stat3基因表达的siRNA。它利用DNA介导的RNA干扰技术构建Stat3基因特异性的RNAi，用于观察细胞内Stat3被特异性抑制的情况下表达及信号通路的变化，为从细胞系研究Stat3的功能提供了有效的工具，在研究和治疗与Stat3相关的肿瘤领域有广阔的应用前景。本专利技术的另一目的是提供一种抑制Stat3基因表达的siRNA的制备方法。本专利技术的上述目的可以通过如下措施实现。设计抑制Stat3基因表达的双链siRNA片段。Stat3 RNAi设计序列及其靶向NCBI网站Genbank数据库小鼠Stat3基因(序列号为AY299489)位置分别为第一条(作用部位157-174)5’＞TCACATGCCACGTTGGTG CACCAACGTGGCATGTGACTTTTTT＜3’第二条(作用部位1226-1243)5’＞AGTTCAAGCACCTGACCC GGGTCAGGTGCTTGAACTCTTTTTT＜3’第三条(作用部位1936-1953)5’＞CAGCTGAACAACATGTCA TGACATGTTGTTCAGCTGCTTTTTT＜3’第四条(作用部位2334-2351)5’＞AAGCTGCAGAGACGTGAC GTCACGTCTCTGCAGCTTCTTTTTT＜3’本专利技术含III型RNA聚合酶真核启动子的载体为pBS/U6载体。其中U6启动子是一种III型RNA聚合酶真核启动子，用于启动下游DNA的转录，其转录起始位点是一个G(鸟嘌呤)，转录中止子为连续5-6个T(胸腺嘧啶)。编码区DNA可以转录出具有特异序列的mRNA，该mRNA并不编码可以翻译的氨基酸，而是在细胞内自动形成一个带有环的发卡式RNA，该发卡式RNA可以介导与其具有相同序列的mRNA的降解。本专利技术人致力与于抗肿瘤和基因工程研究，用多年积累的知识和经验开展RNAi抗病毒治疗研究。通过大量的研究和实验证明，利用DNA介导的RNA干扰技术构建Stat3基因特异性的RNAi，可以用于观察细胞内Stat3被特异性抑制的情况下表达及信号通路的变化，为本专利技术为从细胞系研究Stat3的功能提供了有效的工具，因此本专利技术被列为国家自然基金项目和重庆市人口与计划生育委员会2004年第三批科研基金项目。本专利技术采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)阻抑Stat3基因的表达。通过外源导入与内源基因同源的dsRNA(double-stranded RNA-即双链RNA)来介导目标mRNA的降解，从而导致生物体内特异基因的沉默。RNA干扰通过关闭特异基因的表达在基因表达调控、缺陷识别及疾病基因的治疗等方面显出极为重要的应用价值。本专利技术针对胚胎时期Stat3对细胞生长、存活和分化神经发育情况，针对小鼠Stat3的RNA干扰质粒可用于小鼠胚胎，设计出抑制Stat3基因表达的重组质粒pBS/U6-Stat3-RNAi。用siRNA作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RICS结合mRNA。随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段，特异性地抑制靶基因的表达。新产生的dsRNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制Ｓｔａｔ３基因表达的ｓｉＲＮＡ，其特征是包含下列四种ｓｉＲＮＡ的其中任一一种，它们的碱基序列如下：第一条（作用部位１５７－１７４）：５’＞ＴＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣ ＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴＴ＜３’第二条（作用部位１２２６－１２４３）：５’＞ＡＧＴＴＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴ＜３’第三条（作用部位１９３６－１９ ５３）：５’＞ＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴ＜３’第四条（作用部位２３３４－２３５１）：５’＞ＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧ ＡＧＡＧＴＣＡＣＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴ＜３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：星懿展，李泽桂，常智杰，丁震宇，李铁石，张原江，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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