用于检测DNA中的烷基化胞嘧啶的方法技术

本发明专利技术公开了采用一或多种能有区别地修饰烷基化胞嘧啶或胞嘧啶的酶来检测双链ＤＮＡ中的烷基化胞嘧啶的方法。ＤＮＡ的至少一个区域被转化成单链ＤＮＡ并将酶与单链ＤＮＡ中的靶区域反应。通过确定酶对靶区域的酶修饰的水平检测出靶区域中的烷基化胞嘧啶的存在情况或水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测DNA中的烷基化胞嘧啶的方法。本专利技术的方法采用能有区别地修饰烷基化胞嘧啶和胞嘧啶的酶。通过在DNA与至少一种这样的酶温育后评估DNA的酶修饰的水平测定出烷基化胞嘧啶在DNA中的存在情况。对DNA中的烷基化胞嘧啶的检测对于诊断及其他目的都是有用的。
技术介绍
在原核生物、真核生物、噬菌体和/或病毒基因组中已经鉴定出至少七种不同的共价碱基修饰(1)。在更高等的真核生物中，最广泛的共价修饰碱基是位于CpG二核苷酸的鸟嘌呤的5’端的5-甲基胞嘧啶。已经推定甲基化形式在基因转录、X染色体失活、基因组印迹(genomicimprinting)、细胞分化和致癌作用中都发挥着作用(2)。癌细胞的异常表型可归结于定性和/或定量的改变。基于序列的定性改变(遗传突变)被保留在基因组DNA中，这有助于对它们的检测和表征。基于基因表达的信息的遗传被称为表观遗传学(epi-genetics)。通过改变基因的表达以及通过在细胞分裂期间传递DNA甲基化模式，核酸中的胞嘧啶碱基的甲基化可以实现表观遗传。已经频繁地发现癌细胞含有遗传的和表观遗传的突变。肿瘤细胞同时含有与甲基化模式相关的多种异常。它们经常具有广泛分布的基因组的低甲基化和更多的局部区域的超甲基化(1)。已经发现位于基因启动子区域内的正常未甲基化的CpG岛的局部甲基化与相关基因的下调有关。这种超甲基化可以作为编码用于失活肿瘤抑制基因的局部突变的另一种机制。与人类肿瘤相关的具有CpG岛超甲基化的基因实例包括p16(肺、乳腺、结肠、前列腺、肾、肝、膀胱、和头颈部肿瘤)、E-cadherin(乳腺、前列腺、结肠、膀胱、肝肿瘤)、von Hippel Lindau(VHL)基因(肾细胞肿瘤)、BRCA1(乳腺肿瘤)、p15(白血病、Burkitt淋巴瘤)、hMLH1(结肠)、ER(乳腺、结肠、肺肿瘤；白血病)、HIC1(脑、乳腺、结肠、肾肿瘤)、MDG1(乳腺肿瘤)、GST-π(前列腺肿瘤)、O6-MGMT(脑肿瘤)、降钙素(癌、白血病)、和myo-D(膀胱肿瘤)(1，3)。也已经报告了相反的情况，其中认为CpG低甲基化促进了肿瘤进展。例如，发现尿激酶的CpG岛在早期的、未转移的乳腺肿瘤细胞内是超甲基化的，而在高度转移的乳腺肿瘤细胞内是低甲基化的(4)。相似地，与转移相关的S100A4基因内的一个区域的低甲基化已经被推定为结肠腺癌细胞株的基因活化的机制(5)。至少8种不同的方法与它们的一些变异方法一起可以表征DNA基因组的5-甲基胞嘧啶或相关的修饰碱基(2)。每种方法在特异性、分辨率、敏感性和潜在的人为假象上都有着优点和缺点。通过将DNA通过化学方法或酶学方法水解为其组成核苷酸、然后用标准方法(层析法、电泳法和高压液相层析法)将其分镏和分析就可以测定出基因组的总的核酸碱基组成。这个方法可定量基因组中所存在的修饰碱基的数量，但它没有给出任何关于基因组的哪一部分最初是被修饰的信息。通过最近邻位序列分析可以测定出二核苷酸的组成和频率，但是这个方法也只能生成有限的序列信号。所有的这些方法都不是基因组特异性的，且来自病毒和其他的体内寄生虫对样品的污染都可以导致令人误解的结果。现有的更为特异的方法能提供关于修饰碱基位于基因组序列的哪个位置的准确数据。用对甲基化敏感的限制性内切酶可以分析基因组DNA。但是，对于这种方法，可以被检测的位点数目受甲基化敏感的限制性内切酶所识别的序列数目的限制。测序能提供序列特异的信息，但是在PCR期间或当在细菌中经分子克隆扩增真核DNA时都不能保留甲基化模式。有必要通过一种甲基化特异性方式有区别地修饰碱基，以产生一种修饰的序列，其中在测序方案期间保留有甲基化特异性改变。目前有三种依赖于分析不同的碱基修饰的方案。所有的这些方案都涉及对DNA的化学处理所诱导的DNA修饰，随后是对DNA序列的分析。根据胞嘧啶的甲基化状态，肼(N2H4)、高锰酸盐(MnO4)、和亚硫酸氢盐(HSO3)都能有区别地修饰基因组DNA中的胞嘧啶碱基。肼对5-甲基胞嘧啶具有比胞嘧啶或胸腺嘧啶更弱的反应性。在DNA与肼温育后，在测序凝胶上对所述DNA进行电泳。比较肼处理的DNA和用其他的碱基特异性化学裂解化合物处理的DNA可以测定出DNA序列。在用肼处理的DNA标本中，与来自基因组DNA的测序反应物的胞嘧啶和胞嘧啶+胸腺嘧啶的特异条带比较，在含有5-甲基胞嘧啶的序列位置上出现了条带缺失或强度减低的条带。因此肼方案生成了与5-甲基胞嘧啶的存在相关的阴性结果。对5-甲基胞嘧啶的清晰鉴定要求生成阳性信号。用于5-甲基胞嘧啶鉴定的肼修饰的另一个缺点是需要μg水平的模板DNA。在弱酸性pH和室温下，高锰酸钾优先与胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶反应，而与胞嘧啶和鸟嘌呤的反应较弱。在DNA与高锰酸钾温育后，在测序凝胶上进行DNA电泳。比较用高锰酸钾处理的DNA和用其他的碱基特异性化学裂解化合物处理的DNA可以测定出DNA序列。因此，高锰酸钾对DNA的氧化可被用于区分胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶(6)。尽管高锰酸钾方案生成了阳性结果，并因此具有优于肼方案的优点，但是高锰酸钾的确与胞嘧啶进行较弱反应，因此对胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶的区分依赖于它们在测序凝胶上的条带的强度。高锰酸钾修饰的另一个缺点是也需要μg水平的模板DNA。对基因组DNA的亚硫酸氢盐处理可将核酸模板中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基成尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶可耐受脱氨基作用。亚硫酸氢盐对双链DNA中的胞嘧啶碱基几乎没有活性，所以优选地要将基因组双链DNA变性成单链DNA。标准的亚硫酸氢盐修饰方案使用了强碱(NaOH)进行温育以将双链DNA变性成单链DNA(7)。亚硫酸氢盐缓慢地使胞嘧啶脱氨基，温育时间必须在所有胞嘧啶的完全脱氨基作用和DNA在长时间温育后的片段化之间达到一种妥协。亚硫酸氢盐修饰方案使用了一定范围内的温育时间，通常在亚硫酸氢盐中温育4到20个小时。Grunau等(8)研究了亚硫酸氢盐介导的胞嘧啶脱氨基的最佳条件，他们发现在55℃下温育4个小时使得99％的胞嘧啶脱氨基，但在这些条件下，84％到96％的DNA被降解，减少了后继步骤的产量。另外，加热使得5-甲基胞嘧啶以比胞嘧啶更快的速度脱氨基。例如，在60℃时，5-甲基胞嘧啶的脱氨基速度比胞嘧啶的脱氨基速度高1.5倍(9)。与亚硫酸氢盐在更低温度下的温育减少了DNA的片段化，但是温育时间必须被延长到14到20个小时以实现胞嘧啶的完全脱氨基。亚硫酸氢盐需要近10ngDNA用于随后的使用基于PCR方法的分析。亚硫酸氢盐修饰所产生的修饰的DNA有义和反义链不再是互补的，因此必须用引物进行随后的PCR扩增，引物被设计成是链特异性的，即引物与修饰的有义链或修饰的反义链是互补的。当用PCR扩增相关区域时，尿嘧啶(原先的胞嘧啶)转变成了胸腺嘧啶以及5-甲基胞嘧啶转变成了胞嘧啶(7)。随后可以用标准的DNA测序(7)或生成序列信息的其他的基于PCR的技术例如甲基化特异性PCR(10)或REMS-PCR(36)、和限制性内切酶(3)或甲基化特异性的探针的分析(11)分析PCR产物(扩增子)。尽管亚硫酸氢盐方法具有容易使用和高于其他现有方案的敏感性的优点，但是在试验方案中可以出现潜在的人为假本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测来自个体的基因组或线粒体双链ＤＮＡ样品中的烷基化胞嘧啶的存在情况或水平的方法，所述方法包括：（ａ）获得来自个体的双链ＤＮＡ样品；（ｂ）将双链ＤＮＡ的至少一个区域转化为单链ＤＮＡ；（ｃ）将来自步骤（ｂ）的单 链ＤＮＡ的靶区域与至少一种酶反应，所述酶能有区别地修饰烷基化胞嘧啶和胞嘧啶；以及（ｄ）确定酶对靶区域的酶修饰的水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾利森韦尔伊恩托德，卡罗琳简菲尔瑞，坦亚琳恩阿普尔盖特，
申请(专利权)人：强生研究有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]