苎麻微卫星DNA标记制造技术

本发明专利技术涉及一种苎麻的ＤＮＡ分子遗传标记，提供了１５个苎麻微卫星位点的ＤＮＡ序列及扩增上述１５个苎麻微卫星位点的引物序列和扩增方法，１５个苎麻微卫星位点用于苎麻品种分类、遗传关系分析和标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子标记技术，具体涉及一种苎麻的DNA分子遗传标记。
技术介绍
微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1～6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA，广泛分布于真核基因组中。微卫星序列两侧有保守的DNA序列，根据其两侧的保守序列设计引物，可用PCR扩增出微卫星位点的序列。由于微卫星中重复单元的重复的次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性(即SSRLP或SSR)。由于其具有多态性丰富、重复性高、共显性遗传等优点，被广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传关系分析，品种鉴定等领域。如用微卫星标记分析苎麻品种的亲源关系(Zhou等，2005，Progress in Natural Science，15137-142)、用微卫星DNA标记进行猪品种分类的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”(公开号CN 1370834A)。 苎麻(又称为“中国草”，种名为Boehmeria nivea(L.)Gaud)属于荨麻科苎麻属，是我国重要的纤维经济作物。苎麻的品种分类、遗传关系分析等一般是根据形态、生理指标进行，准确度低、且受生长季节、发育时期等的限制。苎麻的分子标记的研究起步较晚，有研究者尝试用RAPD(随机扩增多态性DNA)标记进行了苎麻品种亲源关系分析，取得了成功(郭安平.RAPD.湖南农业大学博士学位论文，1999.)。但是，RAPD标记在绝大多数情况下是显性标记，不能区别纯合基因型与杂合基因型。如何解决苎麻品种分类、遗传关系分析中存在的准确度低及受生长季节、发育时期限制的问题，是开展苎麻研究迫切需要解决的技术。
技术实现思路
本专利技术旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立苎麻的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行品种分类、遗传关系分析和辅助育种。 实现上述专利技术目的的技术方案包括苎麻(CT/AG)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到15个含有(CT/AG)n微卫星克隆，确定了15个多态性丰富的微卫星标记BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33；BN19为674个核甘酸、BN20为571个核甘酸、BN21为653个核甘酸、BN22，BN23，BN24均为760个核甘酸、BN25为529个核甘酸、BN26为472个核甘酸、BN27为338个核甘酸、BN28为366个核甘酸、BN29为542个核甘酸、BN30为670个核甘酸、BN31为1068个核甘酸、BN32为649个核甘酸、BN33为326个核甘酸。 附图说明 图1是用BN19位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图2是用BN20位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图3是用BN21位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图4是用BN22位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图5是用BN23位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图6是用BN24位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图7是用BN25位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图8是用BN26位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图9是用BN27位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图10是用BN28位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图11是用BN29位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图12是用BN30位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图13是用BN31位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图14是用BN32位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图15是用BN33位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图具体实施方式1苎麻(CT/AG)n微卫星富集文库的构建(1)按郭安平等方法(参见郭安平等，1997，中国麻作，194-10)提取苎麻基因组DNA。用限制性内切酶Mse I酶切苎麻基因组DNA，酶切产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300-1000bp大小的DNA片段并用凝胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)纯化回收的酶切产物。 (2)将碱基互补的寡核苷酸PHC-1(5’-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3’)和磷酸化的寡核苷酸PHC-2(5’-phos-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3’)等摩尔混合，95℃变性5分钟，60℃退火1小时，形成具有MseI粘性末端的接头。 (3)将酶切产物和接头用T4DNA连接酶连接。连接产物用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，离心收集上清液。在上清液中加0.3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇清洗一次，真空抽干DNA后溶于50μl无菌水中。 (4)用生物素标记的寡核苷酸探针(CT)15与连接产物DNA片段杂交。具体操作为在总体积100μl杂交液(6×SSC，0.1％SDS)中加入500ng连接产物和100pmol生物素标记的寡核苷酸探针，并在95℃下变性10min，60℃杂交1小时。 (5)加入100μl(10μg/μl)磁珠(Dynabeads M-280，购自Dynal Biotech公司)，并在室温放置30分钟。 (6)用磁铁吸附磁珠，弃上清。磁珠用400μl洗涤缓冲液(6×SSC，0.1％SDS)在60℃下洗涤15分钟，然后在室温下用分别用2×SSC和1×SSC溶液洗涤两次，并弃上清。 (7)最后加入50μl无菌水，在90℃下保温10分钟，小心吸取上清，上清液即为含有(GA)n重复序列的单链DNA片段。以PHC-1为引物，以单链DNA片段为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。 (8)将扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体(购自大连宝生物公司)上，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌液涂抹在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。 2.含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计(1)挑取白色菌落并接种到3ml LB培养液中，于37℃培养过夜，然后提取质粒。 (2)质粒DNA为模板，采取PIMA方法(参见Lunt等，1999，Molecular Ecology，8891-894)筛选含有(CT/AG)n微卫星序列的阳性克隆。 (3)将阳性克隆测序，分析是否含有(CT/AG)n重复序列。通过测序，共得到了16个含(CT/AG)n微卫星序列的阳性克隆。 (4)根据微卫星重复序列两侧的保守序列设计引物。 3.利用苎麻微卫星DNA标记分析苎麻品种间的遗传差异将上述微卫星标记用于25个苎麻品种的分类，确定了15个多态性丰富、适于苎麻品种分类的微卫星标记BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33(表1)。具体操作过程如下(1)按郭安平等方法(参见本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苎麻微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记的编号分别为ＢＮ１９、ＢＮ２０、ＢＮ２１、ＢＮ２２、ＢＮ２３、ＢＮ２４、ＢＮ２５、ＢＮ２６、ＢＮ２７、ＢＮ２８、ＢＮ２９、ＢＮ３０、ＢＮ３１、ＢＮ３２、ＢＮ３３其核甘酸序列是：ＢＮ１９： ｔａａａｔｔｇｔｇａａｇｇｃｃａｔｔｔｔｇｇｇｃｃｔｔｃａｃｔｔｔｇｔｔｇａａｔｇｃｃｃａａｃｃｃａｔｔｔａｔｇｇｇｃｃ６０ｔａａｃａｇｃａａｇａａａｇｃｔｇｔｇａａｇｇｃｔａｔｔｔｔｃｇ ａｃｃｔｔｇｔｔｃｔａｇｃｇｃｃｔｃａｔａａｇｔｇｇｃｔ１２０ａａｃｇｃｃｃａｔｔｔｇｔａｔｃｔｔｇｇｃｃａａａｔｇｔｇｔａａｇａａｇｇｃｃｔｔｇａａｃｃｔａｇｔａｇｔｇｇｇｃｃａｃ１８０ ｔｔａａｔｔａｃｔｃａａａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇ２４０ａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇｇｇｇ ｔｔｔｔｃｔｇａｇａｔｇｇｇｃｔａｇｃｔｃａａａｇ３００ｔｃａｇｇｔｇｇｇｃｃｔｇｇｃｇｔｔｇｇｃｃｃｇａａａｔｇａｃｃａａａｃｔｃｇａｃｃｃｇａｃｃｃｇｇａａｇｔｇａｃｃａａ３６０ｃｃｔ ｃｇｇｇｔｃａａｇａａｇｔｇａｃａｃｇｔｇｇａｃａｇａａｇｔａｃｃｔａａｃ　ｔｇｔｃａｇｃｃｔｃａｇｇｔａａｔｔｔｃ４２０ａｔｇｇａａｇｔｇｇａｔａａａｇａａａｃａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｇｃ ｇｃｇａｇａｔｔｔｔａｇｃｇｃｃｔｔｔｔａａｃ４８０ｃａｇａｃａｃａａｃｃｇｔｔｃｃａａｇｔｔｔｔｇａａａａｇｃｇｃｔａｔａａｇｇｇｔｇａａｔｃｔｇｃｔｃｃａｃｇａｃａｇａ５４０　ｔｔｃｇ ａｔｔｔｃａｔｃａｔｔａｃｔｔｔｃｇａａｃｃｃａａａａｇａｃｔｔｃａａｔｔｇａｃｇａａａｇｃｃｔｔｃｔｔｔａｔｃ６００　ｔａａｔｔｇａｔａａａｃａａｔａｔｔｔｔｔｇａｃａｃｃｃｇｃａａａｔｃｃａｔ ａｔａａｇｔｇｃａａｔａｃｔｔｃａｇａｔｔｔ６６０ｔｔｔｃａｃｇａｔｃａｔｔｔ６７４ＢＮ２０：ｔａａｇｇｃｔｔｇｔｔｇｇａｃｃ...

【技术特征摘要】
1.一种苎麻微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记的编号分别为BN19、BN20、BN21、BN22、BN23、BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33其核甘酸序列是BN19taaattgtga aggccatttt gggccttcac tttgttgaat gcccaaccca tttatgggcc 60taacagcaag aaagctgtga aggctatttt cgaccttgtt ctagcgcctc ataagtggct 120aacgcccatt tgtatcttgg ccaaatgtgt aagaaggcct tgaacctagt agtgggccac 180ttaattactc aaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 240agagagagag agagagagag agagagagag aggggttttc tgagatgggc tagctcaaag 300tcaggtgggc ctggcgttgg cccgaaatga ccaaactcga cccgacccgg aagtgaccaa 360cctcgggtca agaagtgaca cgtggacaga agtacctaac tgtcagcctc aggtaatttc 420atggaagtgg ataaagaaac agagagagag agagagcgcg agattttagc gccttttaac 480cagacacaac cgttccaagt tttgaaaagc gctataaggg tgaatctgct ccacgacaga 540ttcgatttca tcattacttt cgaacccaaa agacttcaat tgacgaaagc cttctttatc 600taattgataa acaatatttt tgacacccgc aaatccatat aagtgcaata cttcagattt 660tttcacgatc attt 674BN20taaggcttgt tggacctcca agtgagtccc taatacttat tataatatat tatatgttca 60aatactcagt tgggatcaaa acaactttgt 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【专利技术属性】
技术研发人员：揭雨成，蒋彦波，周建林，张健，
申请(专利权)人：中国农业科学院麻类研究所，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]