核酸酶和复合体及其使用方法技术

本发明专利技术涉及利用多组分核酸复合体（ＭＮＡ复合体）级联的方法。ＭＮＡ复合体可具有切割或连接酶的活性。进一步，本发明专利技术提供了可包括一个或多个ＤＮＡ核酶的级联。本发明专利技术还提供了使用这些级联用于靶的鉴定、检测和定量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用多组分核酸(multi-component nucleic acid，MNA)复合体的 方法。MNA复合体可以是具有诸如连接酶或切割活性的修饰活性的活性酶(例如MNA酶 (MNAzymes)，包括适体-MNA酶(apta_MANzymes))。此外，本专利技术涉及使用MNA酶并且也可 以包括一个或更多DNA核酶(DNAzymes)的级联。本专利技术还涉及使用这些级联用于靶的鉴 定、检测和定量的方法。
技术介绍
各种出版物(可包括专利、公布的申请、技术论文和学术论文)在整个说明书中在 括号中引用，每种出版物的完整引用可见于说明书的末尾。每种引用的出版物通过引用整 体并入本文。除了核酸进化上优化的功能外，核酸特别的物理和功能特性为许多新的生物分子 装置和方法提供机会。设计核酸预期用于治疗实体、生物传感器、纳米级装置和用于分子计 算的工具。方法利用了 DNA自装配、导电性、信息元件、扩增、转换、分子检测和催化活性的 特征。此外，由于DNA是粗壮的、稳定的和热稳定的，它是用于机械或计算装置的分子工程 的理想材料。单链核酸，诸如DNA和RNA，能折叠成可作为高度特异性受体(例如适体)和催化 剂(例如核酶、DNA核酶)起作用的复杂的三维结构。此外，杂交对核酸链之间互补性的需 求形成了许多技术的基础，所述技术允许靶检测(例如，微阵列分析、RNA印迹法或DNA印 迹法)和/或靶扩增(例如聚合酶链反应)。此外，杂交为核酸纳米级构建和基于DNA的计 算策略提供了基础。近20年被发现了许多具有酶或催化活性的核酸分子。RNA酶(“核酶”)天然存 在，但可被改造以便特异性识别和修饰靶RNA底物(Haseloff和Gerlach，1988)。体外进化 技术促进了更多催化核酸的发现和发展，包括脱通常称为“DNA酶(DNA enzymes)”或“DNA 核酶”的氧核糖核酸(综述见Emillson和Breaker，2002)。已发现体外进化的能催化许 多反应的DNA核酶和/或核酶，这些反应包括但不限于核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸 化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟 醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形 成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、吓啉金属化、碳-碳 键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸 腺嘧啶二聚体的光逆转或氨基磷酸酯的切割(综述见Silverman，2007)。特别是，已经表征了在通过Watson Crick碱基配对杂交后特异地切割特定核酸序列的DNA核酶和核酶。DNA核酶能切割RNA(Breaker和Joyce，1994 ；Santoro和Joyce， 1997 ；Santoro 和 Joyce，1998)或 DNA(Carmi 等，1996)分子。核酶也能切割 RNA(Haseloff 和 Gerlach，1988)和 DNA(Raillard 和 Joyce，1996)靶序列。“10:23”和“8:17”DNA核酶能在特定的RNA磷酸二酯键处切割核酸底物。这些DNA核酶切割天然的3’ -5’磷酸二酯键合，以便产生具有2’，3’ -环状磷酸和5’ -羟基基 团的反应产物(Santoro 和 Joyce，1997 ；综述见 Emilsson 和 Breaker，2002)。还表征了在与两个独立的底物核酸杂交后特异地连接特定核酸序列的DNA核酶。 特定的脱氧核酶(DNA核酶)可连接2’，3’_环状磷酸和5’-羟基产物，产生非天然的2’-5’ 键合。此类DNA核酶的实例包括“7Z81”和“7Z48”连接酶(Prior等，2004)，以及“7Q10DNA 核酶连接酶(Flyrm-Charlebois等，2003)。可连接2，，3，二醇和5，-三磷酸产物并产生天 然3’ -5’键合的其他DNA核酶已有描述(Coppins和Silverman，2004)。一些催化核酸具有多个结构域的相似的基本结构，这些结构域包括保守的催化结 构域(“催化核心”)，侧翼为两个非保守的底物结合结构域(“臂”)，该底物结合结构域特异 识别底物并与底物杂交。具有上述基本结构的核酸的实例包括但不限于锤头核酶、10:23 禾口 8:17DNA核酶、“7Z81”、“7Z48”和“7Q10”DNA核酶连接酶、“UV1C”胸腺嘧啶二聚体光逆转 DNA核酶和“DAB22”碳-碳键形成DNA核酶。到目前为止，催化核酸一般是单分子的，尽管 具有不只一个组分的催化核酸的实例是已知的，但是这些催化核酸需要广泛的改造(Tabor 等，2006，Kurata 等，2000)。已显示催化核酸在形成催化核心的区域仅耐受某些修饰(Perreault等，1990 ； Perreault 等，1991 ；Zaborowska 等，2002 ；Cruz 等，2004 ；Silverman，2004)。取决于反应条 件的严格性，底物臂内可耐受某种程度的错配。然而，Watson Crick碱基配对的要求是足 够严格的，以致能够开发出使用催化核酸来帮助区分密切相关的序列的方案(Cairns等， 2000)(W0 99/50452)。诸如PCR的靶扩增和检测技术已广泛用于研究和/或临床诊断。然而，尽管这些技 术的能力，每种技术具有内在的缺点。这些技术都要求使用蛋白酶(例如DNA聚合酶、RNA 聚合酶、反转录酶和或连接酶)。包含蛋白酶增加了试剂制造的复杂性和费用，并且降低了 包含试剂的试剂盒的保存期限。其他相关的技术挑战包括受来自先前反应的复制子(靶扩 增子)的污染，引起假阳性信号，和/或由引物序列的复制产生的背景信号(引物-二聚 体)或由不依赖于靶的连接造成的背景。核酸酶和核酸酶级联被认为具有许多生物技术应用，特别在诊断中。通过促进信 号的扩增，核酸酶和核酸酶级联可允许检测蛋白质和核酸来用于疾病诊断。一些研究组已报道使用催化核酸来检测核酸靶和具有比色读数的其他分析物 (Elghanian等，1997，Mirkin等，1996和Liu和Lu，2004)。使用单分子催化核酸的信号扩 增级联的实例在本领域是已知的。例如，Paul和Joyce (2004)描述了一个由具有连接酶活 性的核酶介导的复制级联。在另一个方法中，信号扩增级联使用两种能通过交叉切割导致 线性化而彼此活化的无活性、环化10: 23DNA核酶(Levy和Ellington，2003)。本领域目前需要靶的检测，特别是使用诸如级联的扩增系统的检测，例如涉及包 含多个核酸酶和特别是至少一个多组分核酸酶(MNA酶)的级联的检测系统。本专利技术提供了 涉及包含至少一个具有连接酶活性的核酸酶的核酸酶级联的检测方法。此外，使用具有连接酶活性的核酸酶允许形成核酸复合体组分，诸如装配促进子(assembly facilitator)、 部分酶(partzyme)、底物、DNA核酶或其组分。 专利技术概述本专利技术的一方面提供了一种用于检测至少一个靶的存在的方法，该方法包括(a)提供至少第一核酸复合体的至少两个或多个寡核苷酸组分和至少一个底物， 其中至少第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测至少一个靶的存在的方法，其包括（ａ）提供至少第一核酸复合体的至少两个或多个寡核苷酸组分和至少一个底物，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分能在靶存在下自装配形成包含具有连接酶活性的催化上有活性的多组分核酸酶（ＭＮＡ连接酶）的至少第一核酸酶，（ｂ）使所述两个或多个寡核苷酸组分和至少一个底物与推测含有所述至少一个靶的样品在允许如下的条件下接触：（１）所述至少一个催化上有活性的ＭＮＡ连接酶的自装配，和（２）所述至少一个ＭＮＡ连接酶的催化活性；并（ｃ）确定所述至少一个ＭＮＡ连接酶的催化活性的存在，其中所述催化活性的存在指示所述至少一个靶的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】AU 2007-4-5 2007901833;US 2007-4-5 60/910,427;US 2一种用于检测至少一个靶的存在的方法，其包括(a)提供至少第一核酸复合体的至少两个或多个寡核苷酸组分和至少一个底物，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分能在靶存在下自装配形成包含具有连接酶活性的催化上有活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)的至少第一核酸酶，(b)使所述两个或多个寡核苷酸组分和至少一个底物与推测含有所述至少一个靶的样品在允许如下的条件下接触(1)所述至少一个催化上有活性的MNA连接酶的自装配，和(2)所述至少一个MNA连接酶的催化活性；并(c)确定所述至少一个MNA连接酶的催化活性的存在，其中所述催化活性的存在指示所述至少一个靶的存在。2.一种用于检测靶的方法，其包括a)提供包含需要与所述靶缔合以促进形成第一核酸酶的组分的第一核酸复合体，其中 所述第一核酸复合体还包含至少一个底物，并b)提供能与第一核酸酶催化的反应产物缔合的第二核酸复合体的至少一个组分 并形成能作为第二核酸酶起作用的第二核酸复合体其中所述核酸酶的至少一个具有连接酶活性，并且所述核酸酶的至少一个是MNA酶， 其中所述方法包括i)使推测含有靶的样品与所述第一核酸复合体接触，其中所述靶与所述第一核酸复合 体缔合以促进形成所述第一核酸酶，并 )使第一核酸酶催化的反应产物与所述第二核酸复合体的至少一个组分接触，因此 允许作为所述第二核酸酶起作用的第二核酸复合体的形成，并且其中所述第一或第二核酸酶的至少一个或两者的活性指示所述靶的存在。3.如权利要求2所述的方法，其还包括提供能与所述第一或第二核酸酶或两者催化的反应产物缔合的第三核酸复合体的至 少一个组分并形成能作为第三核酸酶起作用的第三核酸复合体，其中所述方法包括 使所述第一或第二核酸酶或两者催化的反应产物与所述第三核酸复合体的至少一个 组分接触，因此允许作为所述第三核酸酶起作用的第三核酸复合体的形成，并且 其中所述第一、第二或第三核酸酶或其任意组合的活性指示所述靶的存在。4.如权利要求3所述的方法，其还包括提供能与所述第一、第二、或第三核酸酶的至少一个的产物缔合的至少一个其他核酸 复合体的至少一个组分并形成能作为至少一个其他核酸酶起作用的至少一个其他核酸复合体，其中所述方法包括使所述第一、第二或第三核酸酶催化的反应产物与所述至少一个其他核酸复合体的至 少一个组分接触，因此允许作为所述至少一个其他核酸酶起作用的至少一个其他核酸复合 体的形成，并且其中所述第一、第二、第三或至少一个其他核酸酶或其任意组合的活性指示所述靶的 存在。5.如权利要求2-4任一项所述的方法，其中所述核酸酶的至少一个具有切割活性。6.如权利要求2-5任一项所述的方法，其中至少所述第二核酸酶具有连接酶活性。7.如权利要求2-6任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶是MNA酶。8.如权利要求2-7任一项所述的方法，其中所述核酸酶的至少一个是DNA核酶。9.如权利要求2-8任一项所述的方法，其中所述核酸酶的任一个催化的反应产物选自 由装配促进子、部分酶、底物、DNA核酶、稳定臂或其组分组成的组。10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述靶是核酸。11.如权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述组分的至少一个还包含至少一个适 体，并且其中所述方法还包括提供所述第一核酸复合体的至少一个装配促进子和至少一个 装配抑制子，其中所述靶与所述适体缔合，允许所述第一核酸复合体作为第一核酸酶起作用。12.如权利要求11所述的方法，其中所述靶是非核酸靶。13.如权利要求2-12任一项所述的方法，其中所述核酸酶的至少一个或其任何组合催 化的反应产物与之前的核酸复合体的至少一个的至少一个组分缔合，因此允许形成作为另 外的所述之前的核酸酶起作用的所述之前的核酸复合体的另外至少一个。14.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括a)提供第一MNA酶的组分、至少第一 MNA酶的底物、第一 DNA核酶连接酶、第一 DNA核 酶连接酶的底物、第二装配促进子、至少第二 MNA酶的底物和第二 MNA酶的第一部分酶，其 中所述方法包括b)使所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的所述组分在允许所述第一MNA酶的催化 活性的条件下缔合，因此促进所述第一 MNA酶的催化活性，因此允许所述第一 MNA酶底物的 修饰，其中所述第一 MNA酶底物的所述修饰导致第二 DNA核酶连接酶底物的产生；并且其中所述第一 DNA核酶连接酶与所述第一和第二 DNA核酶连接酶底物装配；并且其中所述DNA核酶连接酶的催化活性产生所述第二 MNA酶的第二部分酶，并且其中所述第二 MNA酶的第二部分酶与所述第二装配促进子和所述第二 MNA酶的第一部分酶 在允许所述第二 MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二 MNA酶的催化活性，因 此允许至少所述第二 MNA酶底物的修饰，其中所述底物的任何一个或其组合的修饰指示所 述第一装配促进子的存在。15.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括a)提供第一MNA酶的组分、至少第一 MNA酶的底物、DNA核酶连接酶、第一 DNA核酶连 接酶的底物、至少第二 MNA酶的底物和第二 MNA酶的第一和第二部分酶，并且其中所述方法 包括b)使所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一 MNA酶的催化活 性的条件下缔合，因此促进所述第一 MNA酶的催化活性，因此允许所述第一 MNA酶底物的修 饰，其中所述第一 MNA酶底物的所述修饰导致第二 DNA核酶连接酶底物的产生；并且其中所述第一 DNA核酶连接酶与所述第一和第二 DNA核酶连接酶底物装配；并且其中所述DNA核酶连接酶的催化活性产生所述第二 MNA酶的第二装配促进子，并且其中所述第二装配促进子与所述第二 MNA酶的第一和第二部分酶在允许所述第二 MNA 酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二 MNA酶的催化活性，因此允许至少所述第二 MNA酶底物的修饰，其中所述底物的任何一个或其组合的修饰指示所述第一装配促进子的 存在。16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述第二MNA酶催化的反应产物是允许第三 核酸酶的功能所需的组分。17.如权利要求16所述的方法，其中所述第三核酸酶催化的反应产物是参与所述第二 MNA酶或所述DNA核酶连接酶或两者催化的反应的组分。18.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括a)提供第一MNA酶的组分；至少第一 MNA酶的底物；第二 MNA酶的组分，其中所述第 二 MNA酶具有连接酶活性 ’第二 MNA酶的第二装配促进子；第二 MNA酶的底物；第三MNA酶 的第三装配促进子；至少第三MNA酶的底物和所述第三MNA酶的第一部分酶，并且其中所述 方法包括b)使所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的所述组分在允许所述第一MNA酶的催化 活性的条件下缔合，因此促进所述第一MNA酶的催化活性，因此允许所述第一MNA酶底物的 修饰，其中所述第一 MNA酶底物的所述修饰导致第四MNA酶底物的产生；并且 其中所述第二 MNA酶的装配促进子促进所述第二 MNA酶的组分与所述第二和第四MNA 酶底物的装配；并且其中所述第二 MNA酶的催化连接酶活性产生所述第三MNA酶的第二部分酶，并且其中所述第三MNA酶的所述第一和第二部分酶与所述第三装配促进子在允许所述第三MNA 酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第三MNA酶的催化活性，因此允许至少所述第三 MNA酶底物的修饰，其中所述底物的任何一个或其组合的修饰指示所述第一装配促进子的存在。19.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括a)提供第一MNA酶的组分；至少第一 MNA酶的底物；第二 MNA酶的组分，其中所述第 二 MNA酶具有连接酶活性 ’第二 MNA酶的第二装配促进子；第二 MNA酶的底物；第三MNA酶 的第一和第二部分酶和至少第三MNA酶的底物，并且其中所述方法包括b)使所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一 MNA酶的催化活 性的条件下缔合，因此促进所述第一 MNA酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾莉森威尔彦托德，伊丽莎莫卡尼，崔姆比奇多恩，保罗延扬，海伦安娜斯温，
申请(专利权)人：强生研究有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]